随着多重荧光免疫组化技术的不断发展，越来越多老师希望在自己的片子上看到更丰富的靶标信息，意味着我们需要用到更多种荧光染料去完成染色，但由于荧光染料产生的信号不是单纯的线性，而是呈现山峰状的分布，在最高点信号固然最好，但在最高点左右的一段范围内都能够捕获到它的信号，那么相邻的染料之间，难免会有信号的重叠，导致最后的结果无法被准确判读。

不同荧光染料光谱示意图

 

mIHC结果出现信号重叠，一般表现为两种情况：

 

1、信号完全重叠，没有各自独立信号存在（理论上指标间不存在共定位）

图1：左：merge；中：CD4；右：CD8

 

2、有各自独立的阳性信号，但大部分信号高度重叠（理论上共定位信号没有那么多）

图2：左：merge；中：CD3；右：CD8

图3：红箭头：共定位信号；白箭头：CD8信号

 

可能原因：选用波长十分相近的荧光染料进行了染色；前一轮染色的抗体没有洗涤干净

 

解决方案：

 

1、在选择荧光染料的时候，选择相距波长较远的荧光染料，以Absin的多色试剂盒为例，选择四色（TSA520、TSA570、TSA650、DAPI）、五色（TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI）和七色plus（TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI），这几个试剂盒里的染料之间是几乎不会有串扰的情况。如染料TSA540跟TSA520、TSA570的荧光波长挨得十分接近，TSA650和TSA620挨得很近，在做染料选择的时候就要避开同时应用，比如已经用了TSA520，那在同一个项目中就不要用TSA540再进行染色；如果无法避免必须要同时用，就需要扫描仪或者显微镜具有光谱拆分的功能，完成扫描以后再在工作站进行通道的拆分优化，但至于拆分的效果也取决于染色和成像的效果，所以为了得到一个不错的结果，可能需要实验者不断地调试与优化实验的条件。

 

2、如果所使用的染料之间本身间隔较远，不存在光谱重叠度过高的情况，那出现这种信号的高度重叠，多半是因为前一轮抗体没有洗脱干净，且前一轮的一抗来源恰好跟后一轮相同，当前一轮没有洗干净的时候，残留的一抗也会跟后一轮的二抗结合，导致信号出现重叠。需要优化洗脱的条件。修复液+高压的条件基本都能洗脱得比较干净，但因为条件较强，很容易出现组织从片子上脱落的情况；如果是选择修复液+微波加热的方式，那就需要优化微波修复的条件，Absin实验室推荐可以采用先高火煮沸修复液，取出修复盒后快速插入待洗脱/修复的切片，盖盖子后继续放入微波炉低火维持15min，如果最后洗脱效果不理想，可以延长低火维持的时间，或者调整微波炉的功率，不同微波炉的火力和功率有区别，需要根据具体的实验结果进行更改；如果是选用Absin抗体洗脱液（abs994），则需要关注没洗干净的指标是否是一些较难洗脱的蛋白，如结构蛋白、细胞骨架蛋白、胞浆胞核蛋白，考虑需要延长洗脱的时间或更换更强的洗脱方式（如热修复），或者将难以洗干净的蛋白放到最后顺位去染色。

 

3、当两通道各自存在独立信号，但出现大量非特异性共定位重叠信号：

a. 如图3所示，真正的共定位信号两指标荧光都很强，而非特异性的共定位信号一个指标很强，另一个指标很弱，较容易区分，在不调整实验的情况下，可以通过调整仪器的曝光时间来改善（如图中在CD8通道出现了比较弱的CD3信号，减少CD8通道的曝光时间），因为越长的曝光时间，越容易把背景和相近通道的信号曝光出来。

b. 避免把会存在共表达的指标搭配波长相近染料，如CD3应用了TSA570，则CD8避开使用TSA620，可以选用相距较远的TSA700或TSA520；另外在染色的时候，根据前期预实验的结果，微调各指标的染色条件，比如单标染色发现CD3信号非常强，CD8相对CD3弱很多，在多染的时候染CD3可以再降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，以及染料孵育时间，或CD8增高抗体浓度，延长孵育时间，再搭配曝光时间的调整，也能有效避免信号串扰问题。

c. 如果仪器可以控制拍摄不同通道的顺序，相邻的通道也可以间隔开拍摄，因为荧光信号被激发以后，在信号比较强的情况下，会在片子上留存一段时间，如果紧接着拍摄邻近的通道，有可能这个邻近通道也会接收到上一个通道的残留信号，因此可以考虑间隔开拍摄。

 

更多染色问题或需要技术服务，欢迎大家跟Absin交流哦~

 

货号	产品名称	规格	货期
abs50012	四色多重荧光免疫组化染色试剂盒(鼠兔二抗)	20T	现货
abs50028	四色多重荧光免疫组化染色试剂盒(兔二抗)	20T	现货
abs50013	五色多重荧光免疫组化染色试剂盒(鼠兔二抗)	20T	现货
abs50029	五色多重荧光免疫组化染色试剂盒(兔二抗)	20T	现货
abs50014	六色多重荧光免疫组化染色试剂盒(鼠兔二抗)	20T	现货
abs50030	六色多重荧光免疫组化染色试剂盒(兔二抗)	20T	现货
abs50015	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒(鼠兔二抗)	20T	现货
abs50031	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒(兔二抗)	20T	现货
abs994	抗体洗脱液(mIHC专用)	30mL	现货

好消息！Absin文献奖励重磅升级！

 

Absin特色产品线：

爱必信(上海)生物科技有限公司 联系邮箱：info@absin.cn 微信公众号：爱必信生物