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科学培养指南——类器官

时间：2022-10-21 点击次数：2372

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类器官简介

类器官（Organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，能够最大程度地模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。

类器官的种类

类器官的发展史

早在 20 世纪 80 年代，“organoid”一词就已经提出, 1907年，美国贝克罗莱那大学教授威尔逊发现通过机械分离的海绵细胞可以重新聚集并自组织成为新的具有正常功能的海绵有机体，是未来类器官技术发展的源头。威尔逊的研究证明了成年的有机体在无需外界帮助、无需从特定的解剖学阶段开始，也具有完整的信息并可以成功发育成新的有机体。当代类器官的发展成果，主要集中在近十余年。2009年，Hans Clevers实验室使用单个鼠LGR5+肠干细胞在体外自组织成为具有肠隐窝-绒毛结构的肠类器官，开启了类器官发展的新篇章。

目前，多种脏器类器官已被成功构建，其中包括小肠、胃、结肠、肺、膀胱、大脑、肝脏、胰腺、肾脏、卵巢、食道、心脏等，不仅包括正常器官组织类器官，还有相应肿瘤组织类器官。近几年涉及类器官研究的文献数量呈直线上升趋势，其中不乏多篇CNS等各大顶级期刊文献。中国发表的类器官文献数量在全球的排名从第六位（2009-2019年）跃至第二位（2020年），今次与美国。2021年，类器官被列为“十四五”国家重点研发计划重点专项，随着相关研究不断深入，我国类器官技术水平将进一步提升，同时在相关企业积极布局下，类器官市场化程度将不断提升。

类器官研究发展进程

类器官模型与其他模型比较

目前主要应用临床药物筛选的模型主要分为2D细胞模型，3D类器官和人源性动物移植模型（PDX）。其中肿瘤药物筛选模型需要满足在短时间内出具药敏检测结果、药物筛查通量高、预测效果准确这三个方面，而类器官在这三方面对比其他药筛方法都显现出了强劲优势。

药筛模型对比（来源：中国网医疗频道）

特点	2D细胞模型	类器官	PDX
生理变现	局限性模型	半生理模型	生理模型
构建时间	短	适中	较长
建模成功率	高	高	低
药物检测通量	很高	高	低
成本	低	适中	高
样本量要求	少	较小活检/手术组织	较大活检/手术组织
血管化、免疫系统	不具备	不具备	具备
操作难以程度	容易	容易	困难
基因编辑	容易	容易	困难
肿瘤异质性	难以实现	可保留	难以实现
临床相关性	低	高	高
生物库建立	可操作	可操作	难以实现

类器官模型的应用

类器官培养

以小肠类器官培养为例操作方法：

实验材料

名称	参数	注意
基质胶		提前化冻
基础培养基	B27 50x；N2 100x；N-Acetyl-L-cysteine1mM；Glutamax100x；HEPES 10mM ；Primocin500x；AdvancedDMEM/F12, ADMEM；细胞因子：Mouse-EGF（鼠源的表皮生长因子）50ng/ml；Mouse R-spondin1 500ng/ml；Mouse-noggin（BMP的抑制剂） 100ng/ml	培养基配置时一次不要太多，建议一次配20ml，配制好后用0.22um的滤器过滤（过滤的目的是除菌），置于4℃可保存4周。
24孔细胞培养板
PBS		灭菌，预冷且加入双抗

实验方法

隐窝分离及接板:

（1）解剖6-8周的小鼠，取胃以下约10cm的小肠，镊子去肠系膜，剪刀沿肠道剪开，用预冷的PBS洗3-5次，用载玻片小心的将小肠表面的绒毛刮去（显微镜下镜检），将刮好的小肠放入50ml离心管中，置于冰上；

（2）将小肠转移至生物安全柜中，用含双抗的PBS清洗3-5次，将小肠转移至25ml 2mmol/L的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化30min；

（3）将消化好的小肠转移至50 ml离心管中用含双抗的PBS 清洗2次；

（4）加入25ml PBS适当摇晃30-50下，取部分悬液镜检。悬浮液用70um的过滤筛过滤到新的50ml离心管中；

（5）重复步骤4，两次收集的滤液800rpm 离心5min；

（6）弃上清，用2ml的ADMEM重悬沉淀，取适量的悬液计数；隐窝的数量控制在5-15个/ul 最佳；

（7）取适当体积的悬液加入到1.5ml的离心管中，室温下800rpm离心5min；

（8）弃上清，用预冷的基质胶重悬（需充分混匀）；

（9）接板，24孔板接50ul的重悬液（注：基质胶种在孔中间避免贴壁）；

（10）将接种好的板于培养箱中放置20-30min；

（11）每孔加500ul完全培养基，然后每隔2-3天换一次培养基，5-7天传代一次。

注：所有的操作都要避免染菌，且组织需尽可能至于冰上。

小肠培养流程图

类器官传代:

（1）将传代的隐窝冰上放置5-10min；

（2）小心吸出上清，并加入预冷的1ml 的ADMEM用大枪头将基质胶打碎，然后调制700ul量程，吹打30下左右，此过程避免产生气泡。可取适量的悬液观察，直至看不到大块的隐窝为止；

（3）将悬液转移至1.5ml离心管中，室温800rpm离心 5min；

（4）后续接板步骤与隐窝接板步骤第8-11步一样。

注：理论上传一次可以扩增3-5倍，但由于操作过程中的损失，因此一般只能扩增3倍。

冻存及复苏：

10%的DMSO，20%FBS，ADMEM补足，将悬液转移至冻存管后，放入冻存盒中于-80℃冰箱中保存24h，若长久保存，24h后需放入液氮罐中保存。复苏参照复苏细胞方法。

肿瘤类器官培养方法以肠癌为例：

实验材料

名称	货号
基质胶	abs9495
Organotial结直肠癌类器官培养基试剂盒	abs9445

试剂盒组成

组分	名称	规格	保存
A组分	结直肠癌类器官缓冲液	100ml	4℃
B组分	结直肠癌类器官基础培养基	100ml	4℃
C组分	organo原代酶解液	25ml	4℃
D组分	organo消化液	25ml	4℃
E组分	organo原代酶终止液	100ml	4℃
F组分	组织保存液	100ml	4℃
G组分	organo冻存液	25ml	4℃

实验方法

1、原代

（1）将组织放入含有特殊组织保存液F的组织取样瓶中放入冰盒4℃，拍照并登记信息。

（2）取样瓶消毒，组织放入培养皿，结直肠癌类器官缓冲液A清洗三次后于培养皿中剪碎，大约1mm3的组织块。

（3）癌组织用organo原代酶解液C消化，37℃震荡消化10-20 min，（消化过程中随时观察消化情况）加入三倍体积organo原代酶终止液E终止消化。

（4）使用100μm孔径的筛网进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察，可以看到明显的组织块，将滤液收集后于300g富集离心3-5min后移去上清，重新重悬离心。

（5）去除上清，使用适量基质胶（abs9495）进行重悬(24孔板为例，每孔30ul）之后进行铺板（4℃下操作）拍照追踪定位。

（6）将铺好的板子放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加培养基B（恢复室温）进行培养。

类器官培养流程（基质胶法）

2、类器官传代培养

（1）移液器吸去培养基，添加4℃类器官缓冲液A放置一分钟。

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置5min。

（3）离心5min弃去液体，添加适量类器官缓冲液A重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体或（添加适量消化液D作用90-120S终止，离心5min弃去混合液）。

（4）类器官收集后，添加适量类器官冻存液G，按500个/ml密度冻存（或进行步骤5）。

（5）类器官收集后，基质胶重悬，每孔30μl基质胶铺在24孔板中，放置培养箱中10min添加500μl结直肠癌类器官培养基B。

3、类器官复苏

（1）取10ml于15ml离心管中。

（2）从液氮罐中取出冻存的肿瘤类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。

（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2 分钟内完全融解。

（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 无菌离心管，使用移液管轻轻吹打3次，300g 离心 3分钟，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量结直肠癌类器官缓冲液A重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。

（5）基质胶重悬，每孔20μl基质胶铺在24控板中，放置培养箱中10min添加500μl结直肠癌类器官培养基B。

培养基培养肠癌类器官Day1-Day11的培养照

胃类器官

基础培养基添加物	细胞因子	小分子化合物
N2	EGF	Y-27623
N21	FGF-10	Gastrin
N-Acetylcysteine	Noggin	A 83-01
B27	R-Spondin 1	Nicotinamide
Penicillin/Streptomycin	Wnt-3a	SB 202190
DMEM/F-12
GlutaminePlus

结肠类器官

基础培养基添加物	细胞因子	小分子化合物
N2	EGF	Y-27623
N21	FGF-10	A 83-01
N-Acetylcysteine	Noggin	Nicotinamide
B27	R-Spondin 1	SB 202190
Penicillin/Streptomycin	Wnt-3a
DMEM/F-12
abs817694	A-83-01	5mg
abs810052	CHIR-99021 (CT99021)	5mg
abs810473	DAPT	5mg
abs810530	Dorsomorphin free base	5mg
abs810050	Forskolin	5mg
abs816969	Nicotinamide	50mg
abs810009	SB202190 (FHPI)	5mg

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基质胶

货号	品名	规格	周期
abs9410	即用型基质胶	100ml	现货
abs9490	基质胶（标准型、含酚红）	1.5ml*8	现货
abs9491	基质胶（标准型、无酚红）	1.5ml*8	现货
abs9492	基质胶（高浓度、含酚红）	1.5ml*8	现货
abs9493	基质胶（高浓度、无酚红）	1.5ml*8	现货
abs9494	基质胶（低因子、含酚红）	1.5ml*8	现货
abs9495	基质胶（低因子、无酚红）	1.5ml*8	现货
abs9496	基质胶（IPS验证无酚红）	1.5ml*4	现货
abs9497	基质胶（高浓度、低因子、含酚红）	1.5ml*8	现货
abs9498	基质胶(高浓度，无酚红，低生长因子)	1.5ml*8	现货

细胞因子

货号	品名	规格
abs04176	Recombinant Human Epidermal Growth Factor/EGF	50ug
abs04695	Recombinant Human Noggin	50ug
abs04398	Recombinant Human R-Spondin-1/RSPO1 (C-6His)	50ug
abs04200	Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 2/FGF-2/FGFb (Pro143-Ser288)	50ug
abs04227	Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 4/FGF-4	50ug
abs04177	Recombinant Human Insulin-Like Growth Factor I/IGF-I/IGF1	50ug
abs04228	Recombinant Human Fibroblast growth factor 10/FGF10	50ug
abs00939	Recombinant Human BMP-4	10ug
abs04174	Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein 2/BMP-2	50ug
abs04196	Recombinant Human/Mouse Activin A/INHBA	50ug
abs04355	Recombinant Human Dickkopf-Related Protein 1/DKK1 (N-8His)	50ug

参考文献：

[1] CORNING. Using Organoids for Disease Modeling. Nov. 11, 2019.

[2] Lee, J. et al. Nat Commun 11, 4283 (2020).

[3] SCIENCING. Types of Sea Sponges. 2019.

[4] Wilson, H. V. Development of sponges from dissociated tissue cells.

[5] Sato, T. et al. Nature 459, 262–265 (2009).

[6] Corrò C et al. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.

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