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  • Reverse Transcriptase

    货号: abs60073
    产品说明书
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    货号-规格 货期 价格 数量
    abs60073-10000U 1-2周 ¥630.00
    - +
    abs60073-10000U×5 1-2周 ¥2835.00
    - +
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    产品描述
    描述
    本制品是通过基因重组技术克隆表达M-MuLV的缺失突变型RNase H-的反转录酶。一般的野生型M-MuLV(Moloney Murine Leukemia Virus)具有以下几种活性:依赖于RNA的DNA聚合酶活性;依赖于DNA的DNA聚合酶活性;RNase H活性。由于RNaseH能够催化降解 DNA/RNA杂合体中的RNA,因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶的RNase H活性缺失,延伸能力强,可用于较长的cDNA合成,高比例的全长cDNA文库的构建以及Real Time RT-PCR反应等。
    产品组分:
    组分名称体积(10000U

    Reverse Transcriptase(200 U/μl)

    50ul

    5×RT Buffer

    1ml

    实验方法:
    cDNA 第一链合成反应体系:
    试剂融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
    1) 按顺序加入以下反应物

    模板RNA

    总RNA(0.1 ng -5μg)

    poly(A) mRNA(10 pg)

    特异性RNA(0.01 pg)

    引物

    Oligo (dT)18 1 μl

    Random N6 1 μl

    基因特异性引物15-20 pmol

    5×RT Buffer

    4 ul

    RNase Inhibitor(40 U/μl)

    1 ul

    dNTPs(10 mM)

    2 ul

    Reverse Transcriptase

    1 ul

    RNase Free Water

    至20ul

    2)  如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构,可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后,65°C 孵育5分钟,冰上冷却,再加入其它组分。

    3)  轻轻混匀,离心。42°C 孵育15-30分钟。如果RNA模板中不含poly A结构,25°C 先孵育5分钟,随后42°C 孵育15-30分钟。反应产物可直接用于 PCR,如果不立即使用, -20°C 保存少于一周,长时间保存建议-70°C放置。

    注:有实验结果提示,本反转录酶可在 15 分钟内完成 1kb 反转录反应。

    第一链 cDNA 的 PCR 扩增:

            合成的第一链cDNA可直接用于PCR。

    常用反应体系(50μl)

    2×Taq Master Mix*

    25ul

    上游引物

    0.2-1.0uM(终浓度)

    下游引物

    0.2-1.0uM(终浓度)

    模板

    1-2ul

    ddH2O

    至50ul

    *Mg2+终浓度为 2mM

    常用 PCR 循环:

    94℃

    1 分钟 30 秒

    30 次循环:

    94℃,20 秒

    57℃,20 秒

    72℃,1kb/60 秒

    72℃

    5 分钟

    4℃

    保温
    储存/保存方法
    -20℃,有效期6个月。
    技术指标

    质量保证:经多次柱纯化,SDS-PAGE 胶检测仅可见清晰单一目的条带,PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残留,无核酸内、外切酶污染,无 RNA 酶污染。

    活性定义:以Poly(rA)•Oligo(dT)为模板/引物,在37℃、10分钟条件下, 掺入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位。

    产品用途
    1、1st Strand cDNA的合成;2、cDNA Probe的制备;3、RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。
    注意事项
    1、用DEPC处理实验用到的所有实验器材,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
    2、确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
    3、试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中,所有管子确保扣严。
    4、纯化过的RNA必须保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
    5、为保证反转录反应的有效进行,需使用高质量的RNA模板。
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
    • 实验方法 实验条件
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      • 逆转录酶中RNase-H是否有活性?
      • 酶没有RNaseH活性。
      • 这个产品是否含有甘油?可以做冻干处理嚒?
      • 含有甘油,无法进行冻干。

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