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  • Reverse Transcriptase II

    货号: abs60072
    产品说明书
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    货号-规格 货期 价格 数量
    abs60072-10000U 1-2周 ¥1155.00
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    abs60072-10000U×5 1-2周 ¥5145.00
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    产品描述
    描述
    Reverse Transcriptase II 是对M-MuLV(RNase H-)进行基因工程改造,表达并纯化的高温逆转录酶,比M-MuLV(RNase H-)提高了热稳定性。该酶可以在高温条件下(50~60℃)进行cDNA第一链的合成,高温条件下有利于打开复杂RNA模板链。该酶最佳反应温度为50℃,具有热稳定相强,灵敏度高,特异性高,聚合能力强等优点。
    产品组分:

    产品组成

    体积

    Reverse Transcriptase II(200 U/ul)   

    50ul   

    5× RT Buffer II

    1ml   

    实验方法:

    cDNA 第一链合成反应体系:

    试剂融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

    (1) 按顺序加入以下反应物

    模板RNA

    总RNA(0.1 ng -5ug)

    poly(A) mRNA(10 pg)

    特异性RNA(0.01 pg)

    引物

    Oligo (dT)18 1 ul

    Random N6 1 ul

    基因特异性引物15-20 pmol

    5× RT Buffer II

    4 ul

    RNase Inhibitor(40 U/μl)

    1 ul

    dNTPs(10 mM)

    2 ul

    Reverse Transcriptase II

    1 ul

    RNase Free Water

    至20ul

    (2)可选优化步骤:如果RNA模板GC含量高或含有二级结构,可先将模板与引物的混合液轻轻混匀,短暂离心,65°C 孵育5min,冰上冷却。

    (3)轻轻混匀,离心。

    (4)如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物,50°C 孵育15-30min。 使用随机六聚体引物时,25°C,先孵育5min,随后50 °C 孵育15-30min。对于高GC含量或者具有复杂二级结构的RNA模板,使用60℃孵育 15-30min。

    (5)70°C 加热5min终止反应。反应产物可直接用于 PCR 反应,如果不立即使用,-20°C 保存少于一周的时间。长时间保存建议-70°C 放置。

    第一链 cDNA 的 PCR 扩增:

    合成的第一链cDNA可直接用于PCR。

    常用反应体系(50μl)

    2×Taq Master Mix*

    25ul

    上游引物

    0.2-1.0uM(终浓度)

    下游引物

    0.2-1.0uM(终浓度)

    模板

    1-50ng(质粒)

     10ng-1ug(基因组)

    ddH2O

    至50ul

    *Mg2+终浓度为 2mM

    常用 PCR 循环

    94℃

    1 分钟 30 秒

    30 次循环

    94℃,20 秒

    57℃,20 秒

    72℃,1kb/60 秒

    72℃

    5 分钟

    4℃

    保温
    使用方法
    使用建议:1、用DEPC处理实验用到的所有实验器材,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。2、确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。3、试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中,所有管子确保扣严。4、纯化过的RNA必须保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。5、可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。6、为保证反转录反应的有效进行,需使用高质量的RNA模板。7、最快可达2kb/min,需要提高反转录效率或模板含量较低时可以适当延长反转录时间。
    储存/保存方法
    -20℃
    技术指标

    质量保证:

    经多次柱纯化,SDS-PAGE 胶检测仅可见清晰单一目的条带。PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残留,无核酸内、外切酶污染,无 RNA 酶污染。

    活性定义:

    以 Poly(rA)•Oligo(dT)为模板/引物,在 50℃、10 分钟条件下,掺入 1 nmol 的[3H] dTTP 所需要的酶量定义为 1 个活性单位。

    产品用途
    1、1st Strand cDNA的合成; 2、cDNA Probe的制备;3、RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
    • 实验方法 实验条件
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      • 逆转录酶中RNase-H是否有活性?
      • 酶没有RNaseH活性。
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      • 含有甘油,无法进行冻干。

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