染料法荧光定量PCR试剂盒（抗体修饰）

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问 qPCR实验重复性差的原因以及改进措施有？
答
1. 加样体积失准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。
2. 定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
3. 模板浓度太低：模板浓度越稀，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
4. qPCR mix没有完全混匀：请使用前充分混匀。

问扩增效率低可能的原因有？
答
1. 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2. 反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3. 反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。

问阴性对照出现明显扩增的原因有？
答
1. 反应体系组分（如水）被污染：实验过程中，更换新的Mix或者水重复实验。
2. 标本间的交叉污染或产物污染：反应体系在超净工作台内配制，对实验室进行严格的区分，减少气溶胶污染；使用带滤芯的枪头。
3. 引物二聚体的出现：引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
4. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。