小爱实验Tips：WB实验之大分子量蛋白转膜

时间：2019-08-21 点击次数：23569

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做WB实验转膜时，分子量较大的蛋白较为费时且困难。要实现良好的转膜效率，您可能需要一些小tips。

如上图所示，转膜常用湿转和半干转的方式，小爱常规推荐湿转，即滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”完全浸入缓冲液中，可参考的转膜条件为：转膜至0.2 μm 孔径的NC膜，在冷却的含20%甲醇的转移缓冲液中转膜，70V，1.5h（膜、甲醇含量、电压和转膜时间均可优化调整）。
 
那么大分子量蛋白的转膜需要如何优化条件呢？
1）适当降低凝胶浓度
大分子量蛋白可更加有效地从低浓度的凝胶中转移出来，但凝胶浓度过低容易被撕裂、不太好操作。可以考虑针对蛋白分子量选择6-8%的丙烯酰胺凝胶。当然，您也可考虑选择小爱家的梯度凝胶预制胶产品来有效分离更大分子量范围的蛋白。
2）添加SDS
分子量较大的蛋白容易在凝胶中沉淀，在转膜缓冲液中添加不超过0.1％的SDS可以有效阻止其发生，同时SDS也会抑制蛋白与膜的结合，故其浓度不宜高、且需优化转膜条件以防止蛋白透过膜。
3）降低甲醇浓度
甲醇与SDS具有相反的作用，甲醇可以增加蛋白与膜的结合，它可从蛋白质中剥离SDS。 降低转膜缓冲液中甲醇浓度也有助于防止蛋白沉淀。 一般我们可以将浓度降低至10％或更低。
4）考虑选择较低电压、较长时间、湿转的方式
湿转的效率更高，可以考虑较低电压下过夜转膜。

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实验步骤   推荐指数   货号   产品名称   规格
转膜 　   abs931   PVDF膜0.2 μm   20张
  ★★   abs932   PVDF膜0.45 μm   20张
  ★★   abs959   NC膜0.2 μm   20张
　   abs960   NC膜0.45 μm   20张
缓冲液 　   abs950   10*电转液   100ml,1L
　   abs951   running buffer   100ml,1L
　   abs952   10*TBST   100ml,1L
预制胶   ★★   abs9301   预制胶 10%,10 wells   5片/盒
  ★★   abs9308   预制胶 10%,15 wells   5片/盒
  ★★   abs9302   预制胶 12%,10 wells   5片/盒
  ★★   abs9309   预制胶 12%,15 wells   5片/盒
　   abs9303   预制胶 15% ,10 wells   5片/盒
　   abs9310   预制胶 15% ,15 wells   5片/盒
　   abs9304   预制胶 4-15%, 10 wells   5片/盒
　   abs9311   预制胶 4-15%, 15 wells   5片/盒
  ★★   abs9305   预制胶 4-20%, 10 wells   5片/盒
  ★★   abs9312   预制胶 4-20%, 15 wells   5片/盒
　   abs9307   预制胶 8%, 15 wells   5片/盒
　   abs9306   预制胶 8-20%, 10 wells   5片/盒
　   abs9313   预制胶 8-20%, 15 wells   5片/盒
蛋白染色     abs9255   Ponceau S solution   500ml
  ★★★   abs964   考马斯亮蓝染色试剂盒(常规型)R250   1kit
　   abs965   考马斯亮蓝染色试剂盒(增强型)G250   1kit
　   abs966   Genshare考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液   500ml
 

 

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WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

 

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