Western Blot一抗二抗去除液技术指南

中性/温和型去除液：

采用温和洗涤配方，在不破坏膜上目标蛋白的前提下，通过变性或竞争结合的方式解除抗体-抗原相互作用。适用于大多数常规Western Blot实验，对蛋白损伤最小，膜可以重复利用2-3次。特别适合后续仍需检测表达量较低的目的蛋白的场景。

弱碱性去除液（pH≈10.0）：

主要依靠碱性环境破坏抗体与抗原之间的静电相互作用和氢键。这种温和碱性条件对PVDF膜特别友好，能够有效去除一抗二抗，同时保持膜上蛋白的完整性。适用于ECL等化学发光检测后的抗体洗脱，但不适用于显色法（如DAB、NBT/BCIP）检测后的膜再生。

强碱性去除液（pH≈11.8）：

提供更强的碱性环境，对抗体-抗原复合物的破坏作用更彻底，去除效率更高。同样特别适用于PVDF膜的再生，对硝酸纤维素膜（NC膜）的再生效果相对较弱。由于碱性较强，具有轻微腐蚀性，操作时需佩戴手套等防护装备。

酸性去除液（pH≈2.0）：

通过强酸性条件使抗体蛋白变性失活，从而从膜上脱落。酸性配方对抗体的去除彻底，适用于难以去除的高亲和力抗体或多次重复使用的膜。但需要注意，强酸条件可能对某些酸敏感蛋白造成影响，需评估目标蛋白的稳定性。

PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）：

PVDF膜具有优异的机械强度和化学稳定性，能够耐受各种pH条件的去除液处理，是膜再生技术的首选。其高蛋白质结合容量和耐酸碱性，使得同一张PVDF膜可以重复使用2-3次而仍保持良好的蛋白保留率。

硝酸纤维素膜（NC膜）：

NC膜虽然也能进行再生处理，但效果通常不如PVDF膜。NC膜在强碱性条件下可能部分溶解或变脆，且重复使用的次数有限（通常1-2次）。因此，如果预期需要多次抗体剥离，建议优先选用PVDF膜。

1. 初步漂洗

化学发光检测完成后，将膜从曝光设备中取出，置于蒸馏水中漂洗5分钟，去除残留的显色底物。

2. 孵育去除液

弃去蒸馏水，加入适量一抗二抗去除液，确保液体完全覆盖膜表面（通常8.5cm×5.5cm膜需要15mL左右）

室温摇床孵育15-30分钟（弱碱性配方通常20-30分钟，强碱性15-20分钟，温和型15分钟至1小时）

关键提示：孵育时间应根据目的蛋白调整——对于表达量较高的内参蛋白（如GAPDH、β-actin），可以适当延长孵育时间至1小时或在37°C孵育30分钟以提高去除效率

3. 充分洗涤

弃去去除液，用15mL TBST或PBST缓冲液洗膜3次，每次5分钟，室温摇床振荡。充分洗涤是去除残留去除液的关键，避免影响后续抗体结合。

4. 验证去除效果（可选但推荐）

此时可以用显色方法（如ECL底物）检测二抗是否已完全洗脱。若仍有信号，需重复步骤2-3。

5. 重新封闭

确认膜上无残留酶活性和抗体后，加入15mL封闭液（5%脱脂奶粉或酪蛋白），室温孵育30分钟，或2-8°C封闭过夜。

特别注意：使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗时，封闭液必须用5%脱脂奶粉配制；使用碱性磷酸酯酶（AP）标记的二抗时，必须使用酪蛋白（casein）封闭液

6. 下一轮Western Blot

封闭完成后，按标准流程加入新的一抗，进行下一轮抗体孵育和检测。

适用检测系统：

ECL化学发光系统（Enhanced Chemiluminescence）：这是与一抗二抗去除液兼容性最好的检测方法。ECL基于HRP催化鲁米诺发光，抗体去除后背景干净，再生效果好。

不适用检测系统：

显色法：如DAB（二氨基联苯胺）、NBT/BCIP（硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸）等显色试剂进行的Western检测，由于染料与膜或蛋白形成共价结合或沉淀，无法通过去除液洗脱，因此不适用于膜再生技术。

检测顺序策略：

建议先检测表达量较低的目的蛋白，使用去除液处理后再检测表达量高的蛋白（如内参蛋白）。这是因为：

• 高表达蛋白（如内参）产生的强信号可能在膜上留下"记忆"
• 先检测低表达蛋白可以避免强信号对弱信号的掩盖
• 即使再生不完全，内参的高表达也能保证检测成功

重复使用次数：

虽然理论上膜可以重复使用2-3次，但每次再生处理都会对膜上的蛋白造成一定损伤。建议：

• 首次使用：检测最关键的目的蛋白
• 第二次使用：检测内参蛋白进行标准化
• 第三次使用：条件优化或验证实验

蛋白损失监控：

多次再生后，膜上的蛋白可能会有部分脱落，导致信号减弱。可通过丽春红染色（Ponceau S）在每次再生前后检查蛋白条带的完整性。

安全防护：

• 弱碱性和强碱性去除液具有轻微腐蚀性，操作时务必穿实验服、佩戴一次性手套
• 酸性去除液（pH=2.0）同样具有腐蚀性，需避免接触皮肤和眼睛
• 所有操作应在通风良好的实验室环境中进行

去除液残留：

• 去除液若未完全清洗干净，会严重干扰后续抗体的结合，导致信号减弱或背景升高
• 建议增加洗涤次数或延长洗涤时间（特别是使用强碱性去除液后）
• 可在洗涤后用pH试纸检测膜的pH是否恢复至中性范围

封闭液选择：

必须根据二抗标记的酶类型选择正确的封闭液。错误选择封闭液（如AP系统使用脱脂奶粉）会导致高背景或假阴性结果。

膜干燥：

再生过程中应避免膜完全干燥，干燥会导致蛋白不可逆结合和膜脆化。各步骤之间转移膜时，保持膜处于湿润状态。

样品珍贵性：

• 对于极其珍贵的样品（如临床标本、原代细胞），建议先进行预实验验证再生条件
• 首次使用某品牌去除液时，建议先用内参抗体测试再生效果，确认蛋白保留率和抗体去除效率后再正式实验