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基质胶(OrganoGel)用于类器官3D体外培养操作手册

时间:2022-07-21 点击次数:1194

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产品背景



基底膜是动物体内上皮细胞基底面的一层基质膜。OrganoGel 是从小鼠肿瘤组织提取的基底膜成分, 所形成的基质胶。该基质胶主要成分为 laminin,collagen IV,heparan sulfate proteoglycans(Kleinman et al. 1986)。同时,该基质胶也包含多种生长因子,例如表皮生长因子 EFG,血小板衍生生长因子 PDGF, 神经生长因子 NGF,碱性成纤维细胞生长因子 FGF-2,乙型转化生长因子 TGF-beta 和胰岛素样生长因子 ILGF (Vukicevic et al.1992)。

OrganoGel 实际应用案例


图 1.人胆管类器官在 A 公司的基质胶和 OrganoGel 基质胶中的生长情况。人胆管类器官由细胞核染料 DAPI(蓝色),紧密 连接蛋白抗体 anti-ZO1 和细胞骨架蛋白 F-actin 的染料 Alexa Fluor 647 Phalloidin 染色成像。

图2. 人原发肠癌类器官在A公司的基质胶和OrganoGel基质胶中的生长情况。

图3. 肝癌类器官在A公司的基质胶和OrganoGel基质胶中的生长情况。肝癌类器官由细胞核染料DAPI(蓝色),肝脏细胞生物标志物HNF4a和肝癌标志物GPC3的抗体染色成像。

图4. 人脐静脉内皮细胞 HUVEC 在 A 公司的基质胶和 OrganoGel 基质胶上均可形成血管网络。HUVEC细胞由活细胞染料Calcein AM染色(绿色)成像。

 

操作方法


一、 类器官培养(操作所需时间为 1 小时)

1. 将基质胶于 4°C 冰箱里的冰上过夜解冻。

2. 将 24 孔板放置于培养箱预热。

3. 用预冷的枪头将解冻的基质胶进行分装。

4. 准备病人或者动物组织(或者类器官)来源的,细胞总数为 1X105的单细胞悬液。300g 离心 5min。

5. 取 50µL 的 OrganoGel 基质胶与离心所得的细胞进行混匀。

6. 取出预热的 24 孔板,立即将基质胶与细胞的混合物滴加在孔板里,立即将 24 孔板放入培养箱。

7. 约 10min 后,基质胶凝固后,向孔板里加入 500µL 类器官培养基,放于培养箱进行培养。

 

二、肿瘤类器官药敏实验(操作所需时间为 2 小时)

1. 将扩增好足够量的肿瘤类器官(实验组)以及正常类器官(对照组)用 4°C 预冷的基础培养基进行重悬,缓慢机械吹打,促进胶液化溶解,并保持类器官结构完整(可用于悬浮培养于有 5%基质胶溶液的基质胶表面)(Guillen et al. 2022)。或者通过 TryplE 酶消化获得单细胞悬液。

2. 离心收集类器官细胞,并进行细胞计数。

3. 加入 OrganoGel 基质胶原液,与细胞进行混匀。

4. 将细胞与胶的混合物,通过排枪加入 37°C 预热过的 96 孔板,或者 384 孔板,立即将孔板放入培养箱。

5. 大约 10min 后,OrganoGel 基质胶将凝固,加入相应体积的类器官培养液进行培养。

6. 类器官形成后(如果是机械吹打,类器官将在传代 24h 后就会形成;如果是酶消化,类器官会在 3-5 天 后形成),每个孔分别加入含有 PI 染料以及不同种类、不同浓度的待筛选的抗肿瘤药物。

7. 用高内涵显微镜上进行活细胞成像,测定肿瘤类器官对各种药物的敏感性。

 

三、免疫缺陷小鼠成瘤实验(操作所需时间为 1 小时)

1. 搜集用于注射小鼠的细胞 1X105个,以 1:1 的体积与 OrganoGel 基质胶混合,为方便注射,建议每次注射总体积不低于 100µL。

2. 用脱毛器对小鼠注射部位皮肤进行脱毛,然后用酒精棉球进行消毒。

3. 用不带针头的 1mL 注射器将细胞和胶的混合物吸入针头,再装上 16g 的针头(针头内直径为 1.194mm), 将混合物注射到皮下,或者大腿肌肉(针对代谢特别旺盛的肿瘤细胞)。

 

四、血管生成实验(以永生化 HUVEC 细胞系为例,操作所需时间为 1 小时)

1. 将完全培养基换成饥饿细胞用培养基:加入含 0.2% FBS,2mM L-谷氨酰胺,1mM 丙酮酸钠,100U/ml 青 霉素和 100µg/ml 链霉素的 DMEM 培养基培养 24 小时。

2. 将 OrganoGel 基质胶均匀铺满 96 孔板底。注意:枪头需提前预冷半小时。尽量在冰上操作,避免基质胶过早固化,避免气泡产生。

3. 将 96 孔板在细胞培养箱孵育 30min,固化基质胶。

4. 消化 HUVEC 细胞,并计数。

5. 将 200µL 的 HUVEC 细胞悬液(含 5X104个细胞)加于含基质胶的 96 孔板中。将 96 孔板放于培养箱。

6. 血管样网络结构将于 3 至 12 小时间形成。

7. 在血管网络形成最佳时间,小心去除培养基,并用加入含活细胞染料 1/1000 Calcein AM(绿色)的培养 基进行染色,并用显微镜进行拍照记录。

 

五、神经轴突 3D 生长实验(以大鼠胚胎神经干细胞为例,操作所需时间为 2 小时)

1. 取孕期 12-15 天的大鼠胚胎,用眼科剪和眼科镊分离出大脑皮层于 4°C 预冷的 DMEM 培养基中。

2. 用吸管轻缓吹打,然后用 70µm 滤网过来,获得单细胞悬液,并进行细胞计数。

3. 离心(300g,3min),弃上清。将细胞与 OrganoGel 基质胶进行混合,然后将基质胶混合物滴加在 24 孔 板中,每孔 50µl。

4. 将 24 孔板放于培养箱,大约 10min 后,OrganoGel 基质胶将凝固。加入 1mL 神经元分化培养基:Neurobasal medium,2% B27, 2mM L-glutamine,5%FBS,20ng/mL EGF 和 20ng/mLbFGF,100U/mL penicillin 和 100 µg/mL streptomycin。第二天开始,就能观察到有明显的神经轴突生长。

5. 在第 7 天可观察到大量的神经突(Neurite)长出。

 

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货号

名称

规格

操作

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基质胶(标准型、含酚红)

1.5ml*4/1.5ml*8

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基质胶(标准型、无酚红)

1.5ml*8

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基质胶(低因子、含酚红)

1.5ml*4/1.5ml*8

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abs9495

基质胶(低因子、无酚红)

1.5ml*8

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基质胶(高浓度,无酚红,低生长因子)

1.5ml*8

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基质胶(高浓度、低因子、含酚红)

1.5ml*8

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基质胶(高浓度、含酚红)

1.5ml*8

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基质胶(高浓度、无酚红)

1.5ml*8

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基质胶(IPS验证无酚红)

1.5ml*4

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参考文献:

1.Kleinman HK, et al, Basement membrane complexes with biological activity Biochemistry 25: 312 (1986).

2.Vukicevic , Slobodan, et al. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Experimental cell research 202: 1 (1992).

3.Guillen, K P, et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology . Nature Cancer 3: 232 (2022).

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WB相关:ECL发光液、预染marker、预制胶;IHC相关:二抗试剂盒、组化笔;IP/CoIP试剂盒;激动剂/抑制剂;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡试剂盒;呼吸爆发试剂盒;ELISA试剂盒;重组蛋白;抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体;定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

 

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