胶原酶，助力膝关节软骨研究

时间：2022-05-11 点击次数：245

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软骨细胞的作用

软骨细胞在整个软骨的新陈代谢过程中，发挥着不可替代的重要作用。日常生活中的跑、跳等动作都会导致关节软骨的磨损。软骨细胞还发挥着调控作用，它能分泌一系列细胞和生长因子，对软骨基质的生长、分布、状态等进行「调控式」改建，最终形成符合人体需要的关节软骨。

 

软骨细胞受损与膝关节炎

膝关节炎的发生是关节软骨的磨损造成的。随着年龄的增大、运动的反复损伤和机体条件的改变等原因，日积月累的微小创伤、关节内有害物质的蓄积等都会导致软骨出现损害、皲裂、脱落，最终产生膝关节炎。

 

膝关节软骨的研究与防治

目前防治该病的重点之一即保护退变的关节软骨。但由于临床病例标本获得困难，软骨细胞的样本比较稀缺，因此众多关于该病的发病机制、药物预防及治疗的研究大多多建立在动物模型中进行，从动物关节中获取关节软骨细胞并进行体外培养后进行干预就变得特别重要。

软骨细胞是软骨组织中惟一的细胞成分，软骨组织内无血管及所需营养由软骨基质向内渗入的特点为软骨细胞体外培养提供了可能性。但是软骨细胞存在于软骨基质内的陷窝中，周围包裹着大量的胶原纤维蛋白和蛋白聚糖等大分子结构，因此软骨细胞的获得与体外培养存在一定的难度。

一些研究表明，众多软骨细胞的消化方法随之出现，Ⅱ型胶原酶消化法即是软骨细胞体外分离技术中的常用方法之一。

absin胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。具体可见下面表格：


几种类型的胶原酶的区别及相关应用

   名称    货号    胶原酶活性    用途
   胶原酶Ⅰ    abs47048000    有着初始平衡的胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶的活性。    用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离
   胶原酶Ⅱ    abs47048001    含有更高的梭菌蛋白酶活性。    用于肝脏，骨（软骨细胞），甲状腺，心脏和唾液腺组织细胞的分离
   胶原酶Ⅲ    abs47048002    次级蛋白酶的含量最低但是含有胰蛋白酶活性。    用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动物组织细胞解离
   胶原酶Ⅳ    abs47048003    含有低水平的胰蛋白酶活性以限制膜蛋白和受体的损伤，但是含有正常水平的上述胶原酶的活性成分。    用于胰岛初次分离制备
   胶原酶Ⅴ    abs47048004    部分纯化，含有较高的胶原酶和酪蛋白酶活性。    用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞

 

几种类型的胶原酶的活性

   名称    货号    胶原酶
   u/mg dw		    酪蛋白酶
   u/mg dw		    梭菌蛋白酶
   u/mg dw		    胰蛋白酶
   u/mg dw
   胶原酶Ⅰ    abs47048000    ≥125    ≥200    ≤4.0    ≤0.5
   胶原酶Ⅱ    abs47048001    ≥125    ≥200    ≥3.5    ≥0.1
   胶原酶Ⅲ    abs47048002    ≥100    ≥50    ≤3.0    ≤0.3
   胶原酶Ⅳ    abs47048003    ≥160    ≥100    ≤3.0    ≤0.1
   胶原酶Ⅴ    abs47048004    ≥450    ≥450    ≤3.0    ≤0.3

 

影响胶原酶消化组织的因素及解决方案

   问题    原因    解决方案
   消化作用不佳    酶活性不强    在低温干燥条件下储存胶原酶。
   钙离子不足    胶原酶溶液分装后冻存。
   胶原酶溶液中钙离子浓度为5 mM。
   酶量不足    使用更多的胶原酶。可尝试蛋白酶活性更高的酶混合物。
   解离的细胞被困住    破裂细胞的DNA解离    减少搅动
   加入DNA酶**
   非蛋白胶不足    　
   在消化之前充分冲洗组织***
   使用无镁离子的消化液
   加入透明质酸酶
   细胞死亡    蛋白酶过量    减少蛋白酶接触时间*
   加入白蛋白或灭活血清
   　
   pH 改变    用缓冲液（例如HEPES）代替HCO-3.
   经常检查并重新调节pH
   氧气太少    给消化液通气（空气或氧气）
   用更多的酶加速消化
   细胞产量低    酶平衡    使用更多的胶原酶*
   在胶原酶中加入弹性蛋白酶**
   贴壁因子    首先灌洗组织以除去钙离子++***
   许多细胞受损    过多的蛋白酶    减少蛋白酶用量*
   加入白蛋白或灭活血清
   物理性损伤    非常温和地处理组织和细胞

 



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