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  • Two-Step RT-PCR Kit

    货号: abs60075
    产品说明书
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    abs60075-1kit 1-2周 ¥1365.00
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    产品描述
    描述

    Two-Step RT-PCR Kit两步法RT-PCR试剂盒具有高效合成能力和高扩增效率。该试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板,用2×1st Strand cDNA Synthesis SuperMix进行反转录,然后用2×HotStart Taq Master Mix进行扩增。本试剂盒含有从RNA到cDNA,以cDNA为模板进行扩增的全部试剂,本试剂盒RT 50次/PCR 200次。 

    产品特点:

    操作简单:操作步骤少,降低污染。

    特异性高:使用HotStart Taq酶进行扩增,减少非特异性反应。 
    产品组分:

    组分名称

    体积

    2×1st Strand cDNA Synthesis SuperMix

    500ul

    2×HotStartTaq Master Mix

    1ml×2

    RNase Free Water    

    1ml

    实验方法:

    第一链 cDNA 合成:

    试剂融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

    (1)按顺序加入以下反应物:

    模板 RNA

    总RNA(0.1 ng -5μg)

    poly(A) mRNA(10 pg)

    特异性 RNA(0.01 pg)

    2×1st Strand cDNA Synthesis SuperMix

    10ul

    RNase Free Water

    至20ul

    可选步骤:如果 RNA 模板 GC 含量高或者含有二级结构,可先将RNA 模板和 RNase Free Water 混匀后,65°C  孵育 5 分钟(有助于打开高级结构,便于下一步反应的进行),迅速置于冰上冷却,再加入其它组分。

    (2) 轻轻混匀,离心。

    (3)42°C 孵育 15-30 分钟(如果 RNA 模板中不含 poly A 结构,25°C 先孵育 5 分钟,随后 42°C 孵育 15-30 分钟)。

    (4)产物可直接用于下一步反应。如果不立即使用, 可于-20°C保存一周,长时间保存建议-70°C放置。

    第一链 cDNA 的 PCR 扩增:

    合成的第一链cDNA可直接用于PCR。

    常用反应体系(20μl):

    2×HotStart Taq Master Mix

    10ul

    上游引物

    0.2-1.0uM(终浓度)

    下游引物

    0.2-1.0uM(终浓度)

    模板

    1-2ul

    ddH2O

    至20ul

    常用 PCR 循环:

    当扩增片段<3K

    94℃

    5 分钟

    30 次循环:

    94℃,20 秒

    50-60℃,20 秒

    72℃,60 秒/kb

    72℃

    5 分钟

    4℃

    保温

    当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp)

    94℃

    5 分钟

    30 次循环:

    94℃,5 秒

    68℃,60 秒/kb

    72℃

    5 分钟

    4℃

    保温

     

    储存/保存方法
    -20℃
    注意事项
    1、本试剂盒进行PCR扩增时延伸时间为1kb/min,客户可根据具体片段长度进行延伸时间的调整。
    2、如果同时操作多个样品,建议先在冰上先配制预混液,然后再分装到各个反应管中,加入模板启动反应。
    3、反应扩增时出现目标条带拖带,系模板浓度过高或特异引物浓度不适等原因所致,可对模板及引物浓度等进行调整;反应出现杂带,可对退火温度进行调整,或重新设计特异性高的引物。
    4、为了保证反应的正常进行,需使用高质量的RNA模板。
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
    • 实验方法 实验条件
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