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  • TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-FITC

    • TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-FITC;TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit(FITC)
    货号: abs50033
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    货号-规格 货期 价格 数量
    abs50033-20T 现货 ¥1550.00
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    abs50033-50T 1-2周 ¥2650.00
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    产品描述
    描述
    细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解, 这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍, 表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱,本试剂盒采用 TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3´-OH 末端催化掺入 FITC-dUTP 。 FITC-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞,而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中, TdT 酶催化 dUTP 掺入 断裂的 DNA 链的 3´-OH 末端。抗原标记的 dUTP(如 digoxin-dUTP、生物素-dUTP),因为它可以直接进行原位检测,是一种更快速、直接的检测手段。

    组分20T50T
    A: TUNEL Equilibration Buffer2×1 mL5 mL
    B: TUNEL(FITC) Reaction Buffer2×0.5 mL2×1.25 mL
    C: TdT Enzyme20μL50μL
    D: Proteinase K (2mg/mL)40μL100μL
    E: DNase I (2U/μl ) 5μL13μL
    F: 10×DNase I Buffer100μL260μL
    使用方法
    实验材料(自备) 
    PS 缓冲液(pH~7.4) 
    4%多聚甲醛(in PBS) 
    牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊、牛血清 
    70%乙醇(自选) 
    脱蜡溶剂(石蜡切片样本) 
    实验步骤:
    1、样本准备: 
    1.1 细胞样品
    1) 可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液)。
    2) PBS 清洗细胞两次。 
    3) 细胞固定:加入适量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液,4℃ 放置 30 min。 
    4) PBS 清洗细胞两次。 
    5) 通透细胞:加入冰上预冷的 70%乙醇,在-20℃孵育 4 h。 细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置 20 min。 
    6) PBS 清洗细胞两次。 
    1.2 石蜡组织切片
    1) 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次,每次 5 min,以彻底脱掉石蜡。 注:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。 
    2) 室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次,每次 5 min。 
    3) 室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇 (95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗 1 次,每 次 5 min。 
    4) 室温下,将切片浸没于纯水中漂洗 1 次,每次 3 min,再将切片浸没于 1×PBS 中漂洗 1 次,每次 3 min,用滤纸小心 吸干切片样本周围多余液体。 
    5) 用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。 
    6) 按 1:100 的比例,将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释,使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 20 min。(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。 
    注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为 10~30 min,4 µm 左右的片子可以用 10 min,但 30 µm 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。 
    7) PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 
    注:这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净,否则会严重干扰后 续的标记反应。 
    1.3 冰冻组织切片
    1) 将冰冻切片放置于室温的片架上,室温 20 min,晾干。 
    2) 将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液(in PBS)中,室温固定 30 min。 
    3) PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min。 
    4) 用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。 
    5) 按 1:100 的比例,将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释,使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液, 使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 10 min。Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。 注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为 10~30 min,4 µm 左右的片子可以用 10 min,但 30 µm 左右 的可用 30 min,需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。 
    6) PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 
    1.4 阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进行TUNEL 反应步骤)
    1) 按 1:10 的比例用 ddH2O 将 10 × DNase I Buffer 稀释成 1 × DNase I Buffer 备用。 
    2) 滴加 100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的样本上,室温平衡 5 min。 
    3) 用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/μL), 使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。 
    4) 轻轻吸掉多余液体,加入 100 μL 浓度为 20 U/mL DNase I 工作液,室温孵育 10 min。 
    5) 轻轻吸掉多余液体,PBS 清洗样品 2 次。 
    2. TUNEL 反应 
    1) 每个样本加入 100 μL TUNEL 平衡缓冲液,孵育 5 min。 
    2) 预先配制 TUNEL 反应混合液:每个样本需要已加入 1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反应缓冲液。 
    3) 弃去平衡缓冲液,用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体,每个样本加入 50 μL TUNEL 反应混合液。 
    a) 贴壁细胞,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。 
    b) 悬浮细胞,可加入微孔板中,采用微孔板振荡器进 行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管,使之充分反应。 37℃避光孵育 60 min。 
    c) 组织样本,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内,37℃恒温箱孵育 2 小时,湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。 
    4) 去掉反应液,在 1×PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次,每次 5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3 次,每次 5 min,以降低背景。
    5) (可选)复染:每个样本滴加浓度为 2 μg/mL 的 DAPI 染液,避光室温孵育 10 min。染色完后,轻轻去掉染液,并将样本在 1×PBS 中浸泡润洗 3 次,每次 5 min。 
    6) (可选)封片:将切片样本先纯水浸没 5 min,再放入 70%乙醇浸没 5 min,再 80%乙醇浸没 5 min,90%乙醇浸没5 min,95%乙醇浸没 5 min,无水乙醇浸没 5 min,最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理 2 次,每次 5 min。(通风厨中操作)。脱水完成后,擦去切片周围的液体,每个切片样本滴加 50 μL 抗荧光淬灭封片液,盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。 
    7) 用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析,FITC是一种绿色荧光染料,激发波长、发射波长分别为 485 nm,515 nm (凋亡细胞应被标记上明亮的绿色荧光,没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。
    注意事项
    1、荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
    2、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴口罩、手套操作,接触皮肤,请立即用大量水冲洗。
    基本信息
    别名
    TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-FITC
    储存/保存方法
    本产品应置于-20℃储存,组分B需避光,避免反复冻融。
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
    • 实验方法 实验条件
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      • 单个反应的细胞数量是多少?
      • 流式细胞仪检测推荐细胞总数为3-5 × 106。对于细胞爬片或者涂片,推荐60-90%汇合度。对于常规组织的冰冻切片或者石蜡切片,推荐切片厚度为2-5 μm,避免切片太厚。
      • 是否需要避光?
      • 荧光物质均易发生淬灭,在进行荧光观察时,尽量缩短观察时间,同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
      • 细胞离心条件是什么?
      • 对于悬浮细胞或者细胞悬液,洗涤时候离心条件推荐为300 g、5分钟。
      • 细胞固定条件是什么?
      • 细胞样品固定可以用1%甲醛的PBS溶液或者4%的中性多聚甲醛。组织切片样品推荐用4%的多聚甲醛。
      • 细胞通透处理条件选择?
      • 细胞样品通透推荐用0.2%的Triton X-100或者70%的预冷乙醇-20℃通透1-4小时。细胞样品可以在70%的乙醇溶液中-20℃保存1 周。冰冻切片样品通透可以选择0.5%的 Triton X-100或者20 μg/ml的蛋白酶K。石蜡切片样本推荐用20 μg/ml的蛋白酶K进行通透处理。蛋白酶K做通透处理的时候,需要摸索通透时间,时间太短造成通透不彻底,时间太长容易脱片。
      • 使用时需及时清洗流式细胞仪。
      • PI流式上机时具有一定的粘性,请及时清洗流式细胞仪,避免堵塞。连续上机数量过多也可能导致仪器堵塞导致数据误差,可在检测到一定数量的样本时进行次氯酸清洗,然后进行剩余样本的检测。

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