TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-FITC

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解， 这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍， 表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱，本试剂盒采用 TUNEL 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3´-OH 末端催化掺入 FITC-dUTP 。 FITC-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中， TdT 酶催化 dUTP 掺入 断裂的 DNA 链的 3´-OH 末端。抗原标记的 dUTP（如 digoxin-dUTP、生物素-dUTP），因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。

组分	20T	50T
A: TUNEL Equilibration Buffer	2×1 mL	5 mL
B: TUNEL(FITC) Reaction Buffer	1×1 mL	2×1.25 mL
C: TdT Enzyme	20μL	50μL
D: Proteinase K (2mg/mL)	40μL	100μL
E: DNase I (2U/μl )	5μL	13μL
F: 10×DNase I Buffer	100μL	260μL

实验材料（自备） 
PS 缓冲液（pH~7.4） 
4%多聚甲醛（in PBS） 
牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊、牛血清 
70%乙醇（自选） 
脱蜡溶剂（石蜡切片样本） 
实验步骤：
1、样本准备： 
1.1 细胞样品
1) 可选：准备一份阴性对照样本（加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液）。
2) PBS 清洗细胞两次。 
3) 细胞固定：加入适量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃ 放置 30 min。 
4) PBS 清洗细胞两次。 
5) 通透细胞：加入冰上预冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h。 细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室温放置 20 min。 
6) PBS 清洗细胞两次。 
1.2 石蜡组织切片
1) 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次，每次 5 min，以彻底脱掉石蜡。 注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。 
2) 室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次，每次 5 min。 
3) 室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇 （95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1 次，每 次 5 min。 
4) 室温下，将切片浸没于纯水中漂洗 1 次，每次 3 min，再将切片浸没于 1×PBS 中漂洗 1 次，每次 3 min，用滤纸小心 吸干切片样本周围多余液体。 
5) 用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。 
6) 按 1:100 的比例，将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释，使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。 
注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为 10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。 
7) PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 
注：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后 续的标记反应。 
1.3 冰冻组织切片
1) 将冰冻切片放置于室温的片架上，室温 20 min，晾干。 
2) 将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室温固定 30 min。 
3) PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min。 
4) 用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。 
5) 按 1:100 的比例，将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释，使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液， 使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 10 min。Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。 注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为 10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右 的可用 30 min，需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。 
6) PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 
1.4 阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL 反应步骤)
1) 按 1:10 的比例用 ddH2O 将 10 × DNase I Buffer 稀释成 1 × DNase I Buffer 备用。 
2) 滴加 100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的样本上，室温平衡 5 min。 
3) 用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/μL)， 使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。 
4) 轻轻吸掉多余液体，加入 100 μL 浓度为 20 U/mL DNase I 工作液，室温孵育 10 min。 
5) 轻轻吸掉多余液体，PBS 清洗样品 2 次。 
2. TUNEL 反应 
1) 每个样本加入 100 μL TUNEL 平衡缓冲液，孵育 5 min。 
2) 预先配制 TUNEL 反应混合液：每个样本需要已加入 1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反应缓冲液。 
3) 弃去平衡缓冲液，用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体，每个样本加入 50 μL TUNEL 反应混合液。 
a) 贴壁细胞，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。 
b) 悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进 行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管，使之充分反应。 37℃避光孵育 60 min。 
c) 组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育 2 小时，湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。 
4) 去掉反应液，在 1×PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次，每次 5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100，其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3 次，每次 5 min，以降低背景。
5) （可选）复染：每个样本滴加浓度为 2 μg/mL 的 DAPI 染液，避光室温孵育 10 min。染色完后，轻轻去掉染液，并将样本在 1×PBS 中浸泡润洗 3 次，每次 5 min。 
6) （可选）封片：将切片样本先纯水浸没 5 min，再放入 70%乙醇浸没 5 min，再 80%乙醇浸没 5 min，90%乙醇浸没5 min，95%乙醇浸没 5 min，无水乙醇浸没 5 min，最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理 2 次，每次 5 min。（通风厨中操作）。脱水完成后，擦去切片周围的液体，每个切片样本滴加 50 μL 抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。 
7) 用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析，FITC是一种绿色荧光染料，激发波长、发射波长分别为 485 nm，515 nm （凋亡细胞应被标记上明亮的绿色荧光，没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光）。

1、荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴口罩、手套操作，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-FITC

本产品应置于-20℃储存，组分B需避光，避免反复冻融。