质粒DNA转染解决方案

质粒DNA转染

技术介绍

实验原理
操作步骤
注意事项

实验原理

质粒转染的核心在于利用质粒作为载体，将目标基因转移到宿主细胞中。质粒通常包含目的基因序列、启动子、终止子、抗生素抗性基因等遗传元件。这些元件不仅确保目的基因在宿主细胞中的表达，还帮助筛选成功转染的细胞。常见的转染方法包括化学转染（如阳离子脂质体或钙磷共沉淀法）、电穿孔法等。化学转染法利用阳离子脂质体与质粒DNA结合形成复合物，通过细胞内吞作用进入细胞；电穿孔法则通过电流暂时增加细胞膜的通透性，使质粒DNA进入细胞。

操作步骤

以贴壁细胞为例：

1、细胞准备：

（1）转染前24小时左右对细胞进行转接，培养过夜；

（2）确保转染时细胞密度为90%左右；
（3）最好在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基，以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养不足导致细胞死亡。

2、转染液配置(该步完成后应立即进行转染):

（1）在1.5 ml无菌离心管中加入50µl Trans buffer，再加入适量的转染试剂，见附表。用移液器轻轻混匀后在室温静置5分钟。
（2）在1.5 ml无菌离心管中加入50µl Trans buffer，轻轻混匀，再加入适量的DNA，见附表。用移液器再次轻轻混匀后在室温静置5分钟。
（3）将DNA-Trans buffer混合物滴加至R-Trans buffer混合物中，用移液器轻轻混匀后在室温静置15-20分钟后，立即转染。注意： R-Trans buffer混合物和DNA-Trans buffer混合物的混合顺序非常重要，切勿颠倒。
注意：离心管最好使用聚丙烯离心管。

附表：不同培养体系推荐初始转染条件

培养皿		96 孔板	48 孔板	24 孔板	12 孔板	6 孔板	10cm 皿
表面积cm²		0.35	1.0	1.9	3.8	9.6	59
Trans buffer、试剂、DNA 量	Trans buffer(μl)	20	50	100	200	400	2000
	PM(μl)	0.5	1.3	2.5	5	10	50
	1μg/μl plasmid (μl)	0.16	0.4	0.8	1.6	3.2	16
完全培养基(ml)		0.1	0.25	0.5	1.0	2.0	10

3、转染操作：

（1）将步骤2制备的转染复合物滴加至培养基中，边加边轻轻晃动培养板以使复合物均匀分布。加完后，立即将培养板转入培养箱继续培养。
（2）培养12小时后即可观察，最佳观察或收获时间为24-48小时。

4、后续处理

（1）贴壁细胞在转染4-6小时后更换完全培养基。

（2）悬浮细胞在转染后18-48小时进行细胞换液。

（3）转染18-48小时后可检测基因mRNA水平表达，转染后48-72小时收集细胞样品用于检测蛋白表达。

（4）对于稳定转染，在转染24小时后以1:10传代培养，第二天加入选择培养基。

注意事项

1、细胞状态：确保细胞生长状态良好，无污染，细胞密度适中。细胞过于密集或稀疏都会影响转染效率。

2、转染试剂选择：根据细胞类型和实验需求选择合适的转染试剂，并严格按照试剂说明书进行操作。

3、无血清操作：在配置转染液和转染过程中，需使用无血清培养基，避免血清蛋白干扰DNA-脂质体复合物的形成。

4、混合均匀：在稀释质粒DNA和转染试剂以及混合两者时，需轻轻吹打混匀，避免剧烈振荡。

5、转染时间：根据细胞类型和实验目的优化转染时间，一般6-8小时后更换培养基。

6、转染效率评估：转染后可通过荧光显微镜观察、Western blotting分析、qPCR检测等方法验证转染效果。