免疫细胞化学（Immunocytochemistry, ICC）基于 抗原-抗体特异性结合，通过标记抗体（荧光染料或酶）对细胞内特定抗原进行定位和定性分析：

1. 一抗：特异性识别目标抗原。

2. 二抗：携带标记物（如荧光素、HRP酶），与一抗结合并放大信号。

3. 可视化：通过荧光显微镜观察荧光信号，或通过显色反应（如DAB）显示抗原分布。

1. 试剂清单

类别	主要试剂/材料
细胞处理	细胞培养基（如DMEM）、PBS缓冲液、4%多聚甲醛（固定液）、0.1% Triton X-100（通透剂）
封闭与抗体	封闭液（1% BSA或10%血清）、一抗（特异性抗体）、荧光标记二抗、核染料（DAPI/Hoechst）
封片与保存	抗荧光淬灭封片剂、载玻片、盖玻片
其他	去离子水、湿盒（防止抗体干燥）、移液器及枪头

2. 仪器设备

• 荧光显微镜（或共聚焦显微镜）

• 恒温培养箱、离心机（悬浮细胞需用）

• 37℃水浴锅（可选，用于细胞复苏）

• 暗盒或避光容器（保护荧光标记物）

1. 细胞制备

• 贴壁细胞：将细胞接种于放置盖玻片的培养皿中，待密度达60-70%时处理。

• 悬浮细胞：离心收集细胞，用Cytospin（离心涂片）制备细胞片。

2. 固定与通透

• 固定：4%多聚甲醛室温固定10-20分钟（核抗原）或冷甲醇（-20℃）固定5-10分钟（胞质抗原）。

• 通透：0.1% Triton X-100/PBS溶液孵育5-10分钟（仅需检测胞内抗原时使用）。

• 洗涤：PBS漂洗3次，每次5分钟。

3. 封闭非特异性结合

• 滴加封闭液（1% BSA或10%同源血清）覆盖样本，室温封闭30分钟。

4. 一抗孵育

• 稀释一抗（按说明书建议比例，如1:200），滴加至样本，4℃过夜或室温1-2小时。

• 洗涤：PBS洗涤3次，每次5分钟。

5. 二抗孵育

• 避光条件下，滴加荧光标记二抗（如Alexa Fluor 488/594），室温孵育1小时。

• 洗涤：PBS洗涤3次，每次5分钟（避光操作）。

6. 核染色与封片

• 滴加DAPI（1 μg/mL）染色5分钟，PBS漂洗后吸干水分。

• 滴加抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，轻压排出气泡。

7. 观察与成像

• 荧光显微镜下观察，选择合适的激发/发射波长（如DAPI：358/461 nm，FITC：494/518 nm）。

1. 定性分析

• 阳性信号：荧光信号与目标抗原定位一致（如细胞膜、胞浆或核内）。

• 阴性对照：未加一抗的样本应无荧光信号，排除二抗非特异性结合。

2. 定量分析（可选）

• 使用ImageJ或Imaris软件分析荧光强度，比较不同处理组的抗原表达水平。

3. 图像处理

• 调整曝光时间和对比度，避免过曝或信号丢失；多通道图像需叠加显示（如DAPI+荧光信号）。