均相化学发光（Homogeneous Chemiluminescence）是一种无需分离步骤的检测技术，基于 抗原-抗体特异性结合 或 分子互作 触发发光信号：

1. 标记系统：抗原/抗体或待测分子标记酶（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶ALP）或发光基团（如鲁米诺）。

2. 反应机制：

直接发光：标记酶催化底物（如鲁米诺-H₂O₂体系）产生激发态中间体，退激时释放光子。

能量转移：供体（如铕螯合物）与受体（如XL665）结合后发生能量转移，增强信号。

3. 均相优势：反应全程在液相中进行，无需洗涤分离，操作简便且灵敏度高（可达fg/mL）。

1. 试剂清单

类别	主要试剂/材料
核心试剂	化学发光底物（如鲁米诺、AMPPD）、检测抗体/抗原（酶标记）、标准品/待测样本
缓冲体系	反应缓冲液（PBS或TBS，含稳定剂）、封闭液（如1% BSA）、终止液（可选）
辅助试剂	增强剂（如对碘苯酚）、清洗液（仅需均相模式无需）
其他	96孔化学发光板、封板膜、去离子水

2. 仪器设备

• 化学发光检测仪

• 微量移液器（多通道移液器效率更优）

• 恒温振荡器（控制反应温度）

• 离心机（处理粘稠样本）

1. 样本处理

• 血清/血浆：离心去除颗粒物（3000 rpm，10分钟）。

• 细胞裂解液：BCA法测定蛋白浓度，调整至统一浓度。

2. 试剂配制

• 发光底物：按说明书配制（如鲁米诺:H ₂O₂ = 1:1，现配现用）。

• 抗体/探针：标记抗体稀释至工作浓度（需预实验优化）。

3. 反应体系建立

组分	体积（μL）	说明
样本/标准品	50	梯度稀释标准品（覆盖检测范围）
酶标记抗体	25	避光操作
反应缓冲液	25	含封闭剂及增强剂
总体积	100	轻弹混匀，避免气泡

4. 孵育反应

• 条件：37℃避光振荡孵育30-60分钟（时间依试剂盒要求调整）。

• 终止：若需终止反应，加入终止液（如2M H₂SO₄）后立即检测。

5. 信号检测

• 将反应板置于化学发光仪中，设置参数：

  • 积分时间：100-1000 ms/孔

  • 波长范围：全波长或特定发射滤光片（如425 nm对应鲁米诺）。

• 读取各孔RLU（相对发光单位）值。

6. 数据分析

• 使用软件（如SoftMax Pro）绘制标准曲线，计算样本浓度。

1. 定性判断

• 阳性信号：RLU值显著高于空白对照（通常≥2倍背景值）。

• 阴性对照：仅含缓冲液的孔RLU值应接近本底。

2. 定量分析

• 标准曲线拟合：四参数逻辑曲线（4PL）或线性回归，R²需＞0.99。

• 灵敏度：以空白均值+3SD确定检测下限（LOD）。

3. 异常值处理

• 剔除孔内RLU值超出均值±3SD的数据，重复实验验证。