免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒（磁珠法）

rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit 是一款能够高效完成免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）实验的试剂盒。其包含高性能 rProtein A/G MagPoly Beads，能够实现快速便捷的磁性分离。另外试剂盒内经过优化的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了良好的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。聚合物磁珠的配体是重组蛋白 A/G（约 14 kDa），同时拥有蛋白 A 和蛋白 G 的 IgG 结合结构域，具有更广的抗体亚型结合范围。试剂盒的洗脱方式多样，既可以用低 pH 的洗脱液将免疫复合物从蛋白 A/G 磁珠上洗脱，也可以使用电泳上样缓冲液以变性条件洗脱免疫复合物，直接进行后续检测分析。
本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。

产品组分：

组分名称	10T	50T
rProtein A/G MagPoly Beads	200ul（10mg/ml）	1ml（10mg/ml）
Lysis/Washing Buffer(5×)	10ml	25ml*2
Lysis/Washing Buffer Enhanced	100ul	500ul
Elution Buffer	500ul	1ml*5
Neutralization Buffer	2ml	2ml

1. 缓冲液的准备：
可使用试剂盒准备的缓冲液，也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。Lysis/Wash Buffer(5x）在使用前请稀释至并标记为 1xLysis/Wash Buffer，另根据需求，补加终浓度为 0.1%-1% 的Lysis/Wash Buffer Enhanced，标记为 1xLysis/Wash Buffer(Enhanced)。所有缓冲液在使用前建议用 0.22 um 或者 0.45 um 滤膜过滤，稀释后的缓冲液建议 4°C保存，若试剂浑浊，请立即丢奔。
下列可能用到的试剂及材料未提供，需额外准备：
（1）电泳上样缓冲液，非还原性(5×)：0.3 M Tris-HCl，pH 6.8，5% SDS，50% 甘油0.5% 溴酚蓝
（2）二硫苏糖醇 (DTT)
（3）蛋白酶抑制剂
（4）免疫沉淀所用抗原、抗体

2. 样品准备：
方案1：贴壁细胞的裂解
（1）小心去除单层纽胞的培养基。
（2）用预冷PBS 清洗细胞两次。
（3）根据表2的推荐体积向细胞中加入预冷的 1xLysis/Wash Buffer(Enhanced)。冰上孵育 5min，期间混匀几次。
（4）将上达裂解好的样品转移至一个新的离心管中，约 13000xg 离心 10 min，分离细胞碎片。
（5）将上清转移到一个新管中，进行蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

培养皿大小/表面积	免疫沉淀裂解缓冲液体积
100×100mm	500-1000ul
100×60mm	250-500ul
6孔板	200-400ul/孔
24孔板	100-200ul/孔

注：此表针对各种标准培养皿的1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 的推荐使用体积。

方案2：悬浮培养细胞的裂解
（1）将细胞悬液以 1000×g 离心 5min，收集细胞，奔上清。
（2）用预冷 PBS 将细胞团轻轻重悬，将细胞悬液以 1000×g 离心15min，收集细胞，奔上清。
（3）向细胞团块中加入预冷 1xLysis/Wash Buffer(Enhanced)。每 50mg细胞团块使用 500ul。
（4）将上述裂解好的样品在冰上孵育 5min，期间混匀几次。13000×g 离心 10min，去除细胞碎片。
（5）将上清转移到一个新管中，备蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

3. 免疫沉淀
抗原、抗体与磁珠的结合顺序可根据实际情况调整，不同的孵育顺序对最终纯度及抗原产量均有影响，以下方案为推荐常用的实验方法。
3.1 磁珠漂洗：
（1）将 rProtein A/G MagPoly Beads 充分混匀，取 20ul (0.2 mg) 加入 1.5ml离心管中。
（2）向磁珠中加入 180ul 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，轻微涡旋混匀。
（3）将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。
（4）向离心管中加入1ml 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。
3.2免疫沉淀：
方案1：
（1）向上述准备好的磁珠(步骤 3.1)中加入抗体，抗体推荐用量2-10ug，用抗体保存液或 1×Lysis/Wash Buffer 补充体积至 500ul，室温混旋孵育 30min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。
注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、30min-2h，或者 4°C、1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。
（2）向离心管中加入 500ul 1×Lysis/Wash Buffer，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1min，将离心管置于磁分离器上；待磁珠全部吸附后，吸弃上清，重复至少两次。
（3）向离心管中加入 500ul 细胞裂解样品(步骤2)，每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为 500-1000ug，体积不足500ul可用1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 补足，室温混旋孵育 30min，将离心管置于碳分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。
注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、30min-2h，或者 4°C、1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。
方案2：
（1）在离心管中，将细胞裂解样品(步骤2） 与抗体混合孵育 30min。推荐抗体用量为 2-10ug，每个免疫沉淀反应推荐的细胞裂解液总蛋白量为 500-1000ug，体积不足建议用 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 将样品体积调整至 500ul。
（2）将孵育后的样品加入准备好的磁珠(步骤 3.1)中混旋孵育。
注：孵育温度和时间范国推荐为：室温、30 min-2h，或者 4°C、1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。
（3）将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。
3.3碰珠漂洗：
（1）向离心管中加入 500ul 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，颠倒离心管数次或轻做涡旋混匀 1min，将离心管置于磁分离吸附后，待磁珠全部吸附后，吸弃上清，重复一次。
（2）向离心管中加入 500ul 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，连同磁珠转移至一个新 EP 管中，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。
3.4 洗脱：
方案1：低pH洗脱
向离心管中加入50ul IP Elution Buffer，室温混旋孵育 10min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清为洗脱液，加入5-10 ul Neutralization Buffer。
方案2：备选洗脱方法(变性洗脱）
向离心管中加入50ul (1×)，电泳上样缓冲液，将样品置于金属浴中，96-100°C加热 10 min。通过磁分离器分离磁珠，保留含有目的抗原的上样缓中液。
注：两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原，低pH 洗脱样本中抗体为完整结构，变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链，请根据后续实验需求选择洗脱方案。

4℃保存，有效期1年。

（1）在进行免疫沉淀操作之前，请务必认真阅读此说明书。
（2）除非另有说明，所有操作建议于 4°C下进行。
（3）在保证洗杂效果的前提下，如果使用 1xLysis/Wash Buffer(Enhanced) 洗杂，会造成抗体和介质，或者抗原和抗体之问结合效果降低，建议可以使用 1xLysis/Wash Buffer 进行洗杂。
（4）磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥，使用前请充分混匀。
（5）如果需要在还原条件下洗脱，向1×电泳上样缓冲液中加入DTT（终浓度 10-20 mM)。
（6）经煮沸后的填料易聚集并且失去抗体结合能力,经煮沸的填料不应再次使用。
（7）为保证最佳的实验结果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。
（8）对于免疫沉淀实验，不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到的影响，因此,若本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果，可自行优化缓冲液进行实验。
（9）实验设计时，建议加入对照组，以备后续实验结果分析。
（10）在确定实验结果前，建议保留各步骤抗原、抗体孵育后的样品以备验证。

蛋白A/G磁珠IP试剂盒