RIPA裂解液（强）（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）

(一)贴壁培养细胞
1、取 Weak RIPA Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。
2、去除贴壁细胞的培养液，用 PBS、生理盐水或无血清培养液清洗 1 次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
3、按照 6 孔板每孔加入 150～250μL 裂解液的比例， 加入 Weak RIPA Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解，通常裂解液作用于细胞 1～3s 内，细胞就会被裂解。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μL 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250μL。
4、10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1、取 Weak RIPA Lysis Buffer 置室温溶解混匀后，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。
2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150～250μL 裂解液的比例，加入 Weak RIPA Lysis Buffer 。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μL 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250μL。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
1、取 Weak RIPA Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。
2、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。
4、按照每 20mg 组织加入 150～250μL 裂解液的比例，加入裂解液。冰上或 4℃裂解 15～30min。
5、步骤 3、4 亦可以采用如下过程：按照每 20mg 组织加入 150～250μL 裂解液的比例，加入 Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。
6、10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
7、进行后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

1、去除贴壁细胞的培养液时，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
3、如果细胞量较多，必须分装成 50～100 万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
4、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 Vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5、溶解 RIPA 裂解液时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。
6、裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如 NF-KB、p53 等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。
7、细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或 4℃进行。
8、为了您的安全和健康，请穿戴好个人防护装备和服装进行操作。

-20℃，有效期12个月。