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  • RIPA裂解液(强)(不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂)

    • RIPA Lysis Buffer (Strong) (Without Enzyme Inhibitors)
    货号: abs9231
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    abs9231-100ml 现货 ¥378.00
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    产品描述
    描述

     本品为裂解性较强的1×RIPA 裂解液,不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂,主要成分为50mM Tris-HCl(pH 7.4),150mM NaCl,1% Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,0.1% SDS。使用本品,用户可根据具体用途添加特定抑制剂或不添加抑制剂。经本品裂解所得的蛋白样品,适用于蛋白免疫印迹(Western Blot),免疫沉淀(IP)等实验。

    使用方法
    (一)贴壁培养细胞
    1、取 Weak RIPA Lysis Buffer 置于室温溶解混匀,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。
    2、去除贴壁细胞的培养液,用 PBS、生理盐水或无血清培养液清洗 1 次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
    3、按照 6 孔板每孔加入 150~250μL 裂解液的比例, 加入 Weak RIPA Lysis Buffer。移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解,通常裂解液作用于细胞 1~3s 内,细胞就会被裂解。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μL 裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200~250μL。
    4、10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
    5、后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
    (二)悬浮培养细胞
    1、取 Weak RIPA Lysis Buffer 置室温溶解混匀后,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。
    2、低速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
    3、用手指轻弹细胞,使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150~250μL 裂解液的比例,加入 Weak RIPA Lysis Buffer 。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μL 裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200~250μL。再用手指轻弹以充分裂解细胞,充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
    4、10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
    5、进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
    (三)组织样本
    1、取 Weak RIPA Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。
    2、把组织剪切成细小的碎片,越小越好。
    3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控制在 1~2min 之内,以减少蛋白的降解。
    4、按照每 20mg 组织加入 150~250μL 裂解液的比例,加入裂解液。冰上或 4℃裂解 15~30min。
    5、步骤 3、4 亦可以采用如下过程:按照每 20mg 组织加入 150~250μL 裂解液的比例,加入 Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,该过程尽量控制在 1~2min 之内,以减少蛋白的降解。
    6、10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
    7、进行后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
    注意事项
    1、去除贴壁细胞的培养液时,如果血清中的蛋白没有干扰,可以不用清洗。
    2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。
    3、如果细胞量较多,必须分装成 50~100 万细胞/离心管,然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。
    4、如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈 Vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
    5、溶解 RIPA 裂解液时,应尽量缩短溶解时间,避免裂解液中的有效成分失效。
    6、裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如 NF-KB、p53 等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。
    7、细胞裂解的操作步骤,应置于冰上或 4℃进行。
    8、为了您的安全和健康,请穿戴好个人防护装备和服装进行操作。
    基本信息
    储存/保存方法
    -20℃,有效期12个月。
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
    • 实验方法 实验条件
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