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  • Protein A抗体纯化琼脂糖磁珠

    货号: abs9904
    产品说明书
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    abs9904-10ml 现货 ¥850.00
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    产品描述
    描述

    【产品介绍】Protein A琼脂糖磁珠以交联琼脂糖为基质,Protein A被在磁性微球表面。与同类产品相比,Protein A琼脂糖磁珠表面具有更多的抗体结合 位点。在IP实验中,只需使用更少的磁珠量,非特异性结合低,使用简便有效,具有大面积特异的表面区域,从而大大缩短抗体吸附和抗原结合的时间,可以在 30 分钟内完成 完整的IP实验。此产品适用的范围广泛,例如细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水。

    【产品规格】

    基质

    琼脂糖磁珠

    粒径

    25-125μm

    抗体结合量

    20~30mg Human IgG/mL (100% v/v)

    分散液

    PBS, pH 7.4, 0.1%BSA,0.02%NaN3

    悬浮液浓度

    10%(v/v)

    保存时间

    2~8°C 一年,不可冻存

    【产品特点】抗体结合位点丰富;非特异性吸附低。

    【作用对象】适用于细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等。

    【注意事项】

    1. 进行免疫沉淀操作之前,请务必认真阅读本操作说明书;
    2. 本产品须与磁性分离器配套使用;
    3. 磁珠应保存在储存溶液中,防止干燥;
    4. 请勿将磁珠冷冻或离心,以免引起不可逆聚集;
    5. 为保证最佳的实验结果,请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应;
    6. 操作者可根据实际需求,利用抗体结合反应步骤以及抗原结合反应步骤中收集的上清 液检测抗体、抗原和磁珠的结合情况;
    7. 对于IP实验,不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的,抗体与抗原结合还会 受到结合缓冲液和洗涤缓冲液的影响,因此,如果操作者使用本试剂盒提供的缓冲体系 不能获得很好的实验结果,可自行筛选及配制缓冲液进行实验;
    8. 本磁珠表面包被的重组蛋白Protein A在极端条件下(如低 pH、加热处理)存在极低 的蛋白脱落情况;
    9. 不建议操作者用于分子量约130 kD 目标蛋白的免疫沉淀实验;
    10. 本产品仅供研究使用。
    使用方法

    【操作流程 】

    推荐缓冲液

    Binding/Wash Buffer

    PBST, pH 7.4: PBS ,0.1% Tween-20

    NP40 Cell Lysis Buffer

    150mM NaCl, 1% NP40, 50mM Tris, pH 7.4

    Elution Buffer

    100mM Glycine, pH 2.5,0.1% Tween-20

    Neutralization Buffer

    1M Tris-HCl, pH 9.0



    【抗原样品制备】

    本操作说明书提供以下四种样品处理方法,建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理,使待检测抗原释放至样品溶液中。

    血清样品处理:若目标蛋白丰度较高,建议用 Binding Buffer 稀释血清样品至目标蛋白终浓度为 10~100 µg/mL,置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

    悬浮细胞样品处理:离心收集细胞(4℃,500 g,10 min),弃上清后称重,按 1.0ˣ10^5个细胞20~30 µL的比例加入 PBS 洗涤2次;按1.0ˣ10^5个细胞20~30µL的比例加入NP40 Cell Lysis Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1mM的PMSF),混匀后置于冰上处理10min;离心收集上清液(4℃,14000 g,10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

    贴壁细胞样品处理:移去培养基,用 PBS 洗涤两次;用胰酶消化或者细胞刮刀,收 集至 1.5 mL 离心管内,按 1.0ˣ10^5个细胞 20~30 µL 的比例加入PBS 洗涤 2 次;按 1.0ˣ105个细胞20~30 µL的比例加入NP40 Cell Lysis Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓 度为1 mM的PMSF),混匀后置于冰上处理 10min;离心收集上清液(4℃, 14000 g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

    大肠杆菌样品处理:离心收集大肠杆菌(4℃, 12000 g, 2 min),弃上清后称重,按 每克(湿重)菌体10 mL 的比例用 PBS 洗涤 2 次;按每克(湿重)菌体 5~10 mL 的比 例加入Binding Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为 1 mM 的 PMSF),重悬菌体,超声裂解细胞,离心收集上清(4℃, 17000 g, 10 min)。

     

    【磁珠预处理】

    1. 移液器吹打或漩涡振荡器混匀磁珠,取 50µL 磁珠悬浮液(10%,v/v)至离心管中,5mL磁力架磁性分离去除保存液;注:客户可根据实际需要适当增减;
    2. 加入100 µL PBS 混匀磁珠(颠倒 30 秒或者旋涡振荡器混匀),磁性分离去除上清液(重复 2 次);

    【抗体结合】

    1. 用100µLPBST 稀释 2~20µg 抗体样品(如样品体积大于100ul则不需要稀释),稀释后加入到装有磁珠的离心管中;注:实际抗体使用量需根据实验摸索,可参看磁珠对应不同抗体亚型的亲和力表;
    2. 将上述混合物放入摇床或旋转混合仪室温或 37℃颠倒混匀或者涡旋混匀 10~15 分钟;
    3. 将装有磁珠和抗体的离心管放入磁力架,待磁珠完全贴壁后,去除上清液;
    4. 用100µLPBST 洗涤磁珠-抗体复合物 3 次。

    【抗体交联反应】(备选)

    如操作者需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略本步骤,直接进行下一步骤;本步骤适用于操作者需要单独洗脱目标抗原的试验,推荐使用BS3(Thermo Scientific, Cat. #21580)作为交联剂,相关实验请参照该试剂的操作说明。

    【抗原沉淀反应】

    1. 抗原吸附:向上一步装有磁珠-抗体复合物的离心管中加入制备好的细胞裂解液100~1000µL,用移液枪吹打混匀;
    2. 37℃颠倒混匀或者低速涡旋混匀15~20 分钟,使抗原和结合抗体的磁珠结合;注:为使集合更充分,孵育时间和稳定可根据实际需求进行调整;
    3. 将上一步的离心管和混合物放入磁力架,吸取上清(上清可丢弃也可保存做后续分析);
    4. 取 200µL PBS 洗涤磁珠-抗体-抗原复合物 3 次;
    5. 洗涤完成后用100µLPBS重悬磁珠,用于下一步操作。

    注:抗原洗脱前务必将磁珠转移新的离心管,避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱

    【抗原洗脱】

    本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案,操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

    变性洗脱法
    1. 将装有磁珠-抗体-抗原复合物的离心管放入磁力架,待磁珠贴壁完全后吸去上清;
    2. 向上述离心管中加入25µLElution Buffer和5µL 5x SDS-PAGE Loading Buffer(自备)再用移液器重悬复合物;
    3. 95~100℃煮沸5~10分钟;
    将煮沸后的离心管放入磁力架取上清做后续分析(注:上清液中含有抗原勿丢弃)。

    非变性洗脱法
    1. 将沉淀抗原第5步骤中的磁珠放入磁力架,磁性分离去除上清液;
    2. 向离心管中加入约30µL的Elution Buffer,用移液器轻轻混匀避免气泡产生,颠倒混匀 或者低速涡旋混匀2~5分钟;
    3. 将磁珠放入磁力架,磁性分离收集上清(注:上清液中含有抗原勿丢弃);
    4. 中和:上述步骤收集上清中抗原,若需做功能验证需加入Neutralization Buffer中和洗脱液(例入100µLElution Buffer加入10 µL Neutralization Buffer即可)。

    【磁珠后处理】
    使用后的磁珠用Elution buffer洗涤2次,磁性分离,弃上清液;接着用Binding/Washing buffer洗涤3次,磁性分离,弃上清液,加入200 μL Storage buffer重悬磁珠 ,置于2~8℃保存。

    【磁珠再生】
    1. 磁珠多次使用后会有沉淀蛋白、强疏水性蛋白、脂蛋白等杂质非特异性吸附到磁珠上,为了保证磁珠的使用效率,建议持续使用5次后进行磁珠再生处理。 按约每1 mL 10%(v/v)磁珠加入1 mL 1%(v/v)Triron X-100 磁珠再生缓冲液, 振荡均匀,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转混合,10 min 后进行磁性分离, 弃上清液。
    2. 立即加入1 mL Binding/Washing buffer 进行重悬,然后磁性分离,弃上清液,重复该 操作 3 次。
    3. 加入 1 mL Storage buffer 重悬磁珠 ,置于 2~8℃保存。
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
    • 实验方法 实验条件
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      • 如何解决磁珠易粘附管壁的现象?
      • 建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外,在缓冲液中添加0.01%~0.1%(v/v)的非离子型去垢剂(如NP-40、Tween-20或Triton X-100)可以有效降低磁珠对耗材的粘附。
      • 如何提供高体洗脱效率?
      • 抗体与Protein A 配基亲和度太高导致抗体洗脱效率低,可以通过降低洗脱缓冲液的 pH值(1.9~2.5)、增大洗脱缓冲液的离子强度(可选用2~3 M MgCl2)或延长洗脱时间,提高抗体的洗脱效率。但应注意抗体在低 pH 条件下容易形成聚集物,抗体洗脱产物应马上用碱性缓冲剂(如Tris、HEPES等)调节pH至中性。
      • 如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性?
      • 抗体与样品进行孵育,形成抗体-抗原复合物,再用Protein A 磁珠捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率,并降低磁珠与样品接触的时间,从而提高沉淀产物的特异性。对于ChIP&CoIP也推荐使用此法。
      • 如何提高抗体与磁珠结合效率?
      • 磁珠与抗体的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关,请确认抗体的类型与Protein A 配基的亲和效率(如下表)。增加抗体与磁珠的孵育时间(30~120 min)、提高结合缓冲液的pH 值(8~9)及降低离子强度(25~100 mM NaCl)等方法可提高亲和效率。

        Species

        Antibody Class

        Protein A

        Protein G

        Human

        IgG

        +++

        +++

        IgG1

        +++

        +++

        IgG2

        +++

        +++

        IgG3

        +

        +++

        IgG4

        +++

        +++

        IgM

        +

        -

        IgD

        -

        -

        IgA

        +

        +++

        Mouse

        IgG1

        +

        +++

        IgG2a

        +++

        +++

        IgG2b

        +++

        +++

        IgG3

        +++

        +++

        IgM

        -

        -

        Rat

        IgG1

        +

        ++

        IgG2a

        -

        +++

        IgG2b

        -

        +

        IgG2c

        +++

        +++

        Cow

        IgG1

        +

        +++

        IgG2

        +++

        +++

        Goat

        IgG1

        +

        +++

        IgG2

        +++

        +++

        Horse

        IgG(ab)

        +

        -

        IgG(c)

        +

        -

        IgG(T)

        -

        +++

        Rabbit

        IgG

        +++

        +++

        Pig

        IgG

        +++

        +

        Dog

        IgG

        +++

        +

        Chicken

        IgY

        -

        -

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