2 × 预混实时荧光定量快速PCR反应体系（高浓度ROX）

本产品是采用 SYBR Green I 嵌合荧光法进行实时荧光定量 PCR 的专用 2×浓度预混液。本产品含有优化浓度的HotStart Taq DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和稳定剂等成分。主要用于基因组 DNA 靶 序列和 RNA 反转录后 cDNA 靶序列的检测。HotStart Taq DNA Polymerase 高温加热前，抗 Taq单克隆抗体与 Taq 结合，抑制 Taq 的聚合酶活性，从而抑制在低温条件下出现的由引物和模板 DNA 非特异性杂交或引物二聚体引起的非特 异性扩增。抗体在 PCR 反应的预变性步骤中已完全失活，不会阻碍之后 Taq 酶聚合反应，大大提高了 PCR 反应的灵敏度及特 异性。 优化浓度的 SYBR Green I 荧光染料掺入 DNA 双链后，荧光信号增强，而不掺入链中 SYBR Green I 染料分子荧光信号不 变，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步，荧光可以在退火或延伸阶段测定。
本产品为 2×浓度预混实时荧光定量快速 PCR 反应体系（高浓度ROX），使用时只需加入模板、引物、和水，使其工作浓度为 1×，即可进行反应。具有快速简便、 灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度地减少人为误差、节约 PCR 实验操作时间、降低污染机率。
注意本品发货2×浓度预混实时荧光定量快速 PCR 反应体系和ROX分开发货各一管，参考ROX标签添加使用。

用户需自备的试剂：cDNA 或 DNA 模板、引物。
请按照不同品牌荧光定量PCR仪的使用说明书要求进行实验操作。
操作示例：分别以20 µ l和50 µ l PCR反应体系为例：
1.  PCR 反应体系的建立：

组分	20ul体系	50ul体系
DNA模板	1ul	1ul
正向引物（10uM)	0.5ul	1ul
反向引物（10uM)	0.5ul	1ul
2×RealStar Green Fast Mixture with ROX	10ul	25ul
RNase-free H2O	补足至20ul	补足至50ul

*模板量： 10-100 ng基因组DNA，或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。 另外， Two Step RT-PCR 反应的cDNA（ RT 反应液）作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的10% 。
*引物：通常引物浓度以 0.2 μM 可以得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。为了获得理想的 qPCR 的效果，扩增片段的长度建议为 80-200 bp 。
*不同仪器所需 ROX Reference Dye不同，或需要添加或不需要添加，请根据仪器说明进行操作。
2。PCR 反应条件的设置： 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗体封闭的HotStart DNA聚合酶，如果在PCR反应 前进行模板的预变性，通常设定为95℃、2 min，复杂或高GC模板适当延长时间至5 min。该DNA聚合酶在15 s内可完成至 少300 bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350 bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60 s或者 采用三步法以提高扩增效率。

两步法 PCR 扩增标准程序：
预变性	95℃	2min	40 Cycles
变性	95℃	15s
退火/延伸	60℃	15-30s
溶解曲线（仪器自动设置）

三步法 PCR 扩增程序：
预变性	95℃	2min	40 Cycles
变性	95℃	15s
退火	60℃	15-30s
延伸	72℃	30s
溶解曲线（仪器自动设置）

注 ： 以上举例为常规 qPCR
反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异 ， 需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。
3. 在相应的 real time PCR 仪器上完成实验，并分析结果。

-20℃避光保存，保质期 24 个月，避免反复冻融。如果经常使用，可置于 4℃保存至少 3 个月。

1. 使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。 2. 尽可能减少 RealStar Green Fast Mixture 在光下的曝露时间，长时间的曝光可导致荧光信号减弱。 3. 反应液的配制、分装请一定使用无污染的枪头、Microtube 等，尽量避免交叉污染。 4. 本品不能用于杂交探针法。