Mouse IL-6 ELISA Kit
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- 如果我的样本是组织,有推荐处理组织样本的protocol吗?
- 我们的ELISA试剂盒做组织样本,具体裂解方式参考如下:
1、裂解液配置:建议选择:组织/细胞裂解液 (多因子检测)(abs9225)裂解液,在使用前按100:1的比例加入广谱型
蛋白酶抑制剂混合物(不含EDTA,100×DMSO储液)(abs9161),配置成工作液,现配现用;
2、称量组织,按每10mg加入100ul裂解液工作液进行裂解针对组织,利用组织处理器或者其他组织处理装置,处理
样本,保证样本处理完全;
3、将裂解收的样品10000-14000rpm,4℃离心10min,取上清(建议组织裂解液离心两次);
4、取上清做BCA总蛋白浓度测定,完成后续操作。BCA法测量蛋白浓度请参考BCA 蛋白定量试剂盒(abs9232)说明
书;
5、根据测定的蛋白浓度,将样本稀释成总蛋白浓度为1μg/μl左右即可进行ELISA实验(部分指标需根据预实验结果再
行调整)。
- ELISA数据处理有专门的软件吗?
- 有,可以到如下链接下载免费版软件,点击下载。
同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决?
样本保存不当,会导致多次实验结果偏差较大,样本应尽量减少反复冻融,如需多次检测,需在取样后分装保存。
检测样本是细胞培养上清,那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗?
有影响,所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。
请问标曲是每次都要做吗?
是的,每次实验,孵育时间,洗板次数等等条件均不一样,不同实验的标曲不能混用,做一次实验需要做一次标准曲线,并且用当次,同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度,才能得到准确的结果。
做预实验时每种要做几个复孔呀?
预实验视情况而定,如果整个板子孔数较为充足,建议两个复孔,如不充足,单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。
血清样本少量溶血,颜色稍深,对结果有影响吗?
会有影响,建议取样时需注意,避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限,建议用样本稀释液适当稀释,减少基质效应影响。
试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗?
试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例,但是为大致范围,最好还是根据自己的样本情况,设计预实验测量计算。
加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大?
加完终止液后,显色反应也不是永远停止,形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深,建议在15 min内读数。
复孔差别比较大,是没洗干净吗?
复孔值差异较大,主要原因应考虑加样是否准确,洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。
- 配好的抗体没用完如何保存,可保存多久?预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂,剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗?
一般来讲,配好的母液,可以在四度保存,最多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的,间隔时间不要太长,一个月之内均可,需注意试剂避免污染,板子保持干燥。
最后显示的OD值在多少之间属于可用值,有要求吗?
- 有的,为保证标曲的线性范围,建议最好标曲最高点OD值在0.8-3之间,同时,线性(四参数拟合)较好,副孔值CV值较低(15%以下)时,结果可用。
样本总是在标准曲线之外,稀释100倍也是,怎么办?
在设置稀释倍数之前,需要参考相关文献,对于一些表达极高的蛋白,确实会出现这种情况,建议继续提高稀释比例。
试剂盒推荐用450和540nm双波长检测,但条件有限可否换成450和620的双波长?如何使用校准波长?还有,用空白孔校准可以么?
可以的,TMB底物显色后,吸光峰值在450nm,另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置,避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值,用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法,因为避免了不同孔的读数影响,防止出现空白孔污染,导致读数较高,无法校准的情况。
ELISA可以检测胞内蛋白么?
可以的,选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可,将组织样品或细胞样品进行裂解,提取胞内蛋白后进行蛋白定量,保证每孔上样总蛋白量一致即可。
整个过程需要避光吗?避光需要避到什么程度呢?
- ELISA实验中,在酶标抗体孵育,以及显色底物孵育这两步建议避光,其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹,或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。
标准曲线在推荐的浓度下,r值为0.9,做了多次都是这样,怎么办?
要仔细核对产品说明书,看是否用了推荐的拟合方法,如爱必信的ELISA试剂盒,需要使用四参数拟合方式进行拟合,用错拟合方式,会导致r方值较低;如拟合方式无误,需检查是否有个别标曲孔数值异常,排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。
封板膜什么时候用?每次加液后都要换吗?
封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是,都要盖好封板膜,减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。
手动洗板过程中,拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗?
是需要更换的,防止造成交叉污染,影响实验结果的准确性。
- 有的wash buffer析出结晶后在37℃也不溶解,怎么办?
可提高至55度,并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。
测得的值都低于标准曲线的最低值,是什么原因,应该怎么解决?
基质效应导致,由于样本的基质环境相对于试剂盒中的稀释液更为复杂,可能存在部分成分抑制HRP酶活性,在样本中待测蛋白表达极低,甚至不表达的时候,OD值低于稀释液的值是存在的,按照0计算即可。首先是检查样品是否稀释倍数过高,降低稀释比,直至直接加样本原液,如还检测不出,需排查原因,建议在实验组别设置中添加阳性对照孔,用明确表达的样品作为阳性对照,如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度,则表明实验成功,其余待测样品表达含量低于检测下限,按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见,在健康样本中,表达含量极低。
因为检测限的原因,同一块ELISA板子,部分样本稀释,部分样本1:10稀释,部分1:20稀释,这样设置可行吗?结果可以比较吗?
- 可以比较,不同稀释比例,是因为不同样本间的表达差异较大,只要保证稀释后的检测样品测量值准确,还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。
试剂盒里面有捕获抗体么?
即用型ELISA试剂盒中,捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上,没有单独的捕获抗体提供,直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。
ELISA实验中,检测计算抗原的浓度,临界值怎么确定?
根据曲线测定的浓度,建议落在标准曲线的中间位置较好,极限最好不要超过标准曲线的上下限,如果超出较多,会影响计算结果准确性,建议调整稀释比例。
In vivo周期长的话,不太好做预实验,怎么办?
In vivo造模取样后,可将样品分装,取一部分样品做ELISA预实验,剩余样品再进行正式实验;如多批次实验,操作较为一致,后续可取消预实验,根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。
做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢?多大是高多小是低?
需要根据文献推测,一般在健康人样本中,炎症因子表达很低,接近ELISA检测下限,样品无需稀释或1:1稀释即可,如已知为炎症疾病或造模样本,可参考文献,在预实验中设置1:10-100(或更高)的稀释比例,预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。
- ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机,需要如何操作?
实验室ELISA实验做的较多,还是建议使用洗板机洗板,效果更好,也更方便控制。如果没有洗板机,在洗板过程中,需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出,在加洗板液后,静置1-2min,甩干液体后,在吸水纸上大力拍干;重复三次。
ELISA实验中,酶标抗体识别的是哪个抗体?
在双抗夹心法ELISA中,酶标抗体识别的是检测抗体,对检测抗体进行识别和酶标记。
捕获抗体如何包被在96孔板上?
- 如果选用的是即用型ELISA试剂盒,无需进行抗体包被;如果是非即用型的ELISA试剂盒,首先,要选择ELISA级别的板子,材质应为聚苯乙烯;然后用抗体包被液稀释(pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl)成工作浓度,然后每孔加100 μl稀释后的捕获抗体,室温或4℃过夜包被,然后进行洗板和封闭之后即可使用,如需长期保存,需要真空冻干后保存。
ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么?
不是的,在双抗夹心法ELISA实验中,会同时用到捕获抗体和检测抗体,这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体,这样才可以同时结合抗原分子。
- ELISA可以测DNA的表观么?
- 不可以,ELISA是利用免疫学原理,定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学,主要是检测DNA甲基化,可以选用ChIP技术。
- 高背景的原因有哪些?如何改进?
- 1、手动洗涤时请勿将洗涤液溢出孔外/检查洗板机是否正常工作,调节洗板机“洗涤量”、“洗涤循环”和“抽吸”等参数; 2、封闭的时间和温度是否适当,更换封闭buffer 3、检查底物在使用前是否曝光了,孵育底物过程微孔板是否曝光 4、检查是否按说明书稀释底物 5、加终止液三分钟后即读数
- 重复性差的原因有哪些?如何改进?
- 1.可能样本中有沉淀物、杂质,可以使用前先离心 2. 可能微孔板中有气泡,可以 小心用针尖挑破,注意不要划伤微孔板底部 3.可能微孔包被面被吸头划破,加液时小心操作 4.边际效应,实验之前将微孔板和试剂在室温下平衡,勿将微孔板置于温度变化太大的地方(如通风处、阳光直射处等),铝箔纸包住微孔板底部及下部外沿降低边际效 5.蒸发,各步之间,须使用封版胶密封反应板
标曲做不出来的原因有哪些?如何改进?
1.可能样本中有沉淀物、杂质,可以使用前先离心
2. 可能微孔板中有气泡,可以 小心用针尖挑破,注意不要划伤微孔板底部
3.可能微孔包被面被吸头划破,加液时小心操作
4.边际效应,实验之前将微孔板和试剂在室温下平衡,勿将微孔板置于温度变化太大的地方(如通风处、阳光直射处等),铝箔纸包住微孔板底部及下部外沿降低边际效
5.蒸发,各步之间,须使用封版胶密封反应板" "
1. 标准品是否按说明书推荐重溶,稀释;注意保存方法及期限
2.酶和底物不显色,进行颜色测试以判断酶及显色液是否正常工作
3.显色时间不足/孵育温度低,延长显色时间/选择最适反应温度,确保实验室温度稳定;采用恒温孵育箱注意不要叠放微孔板
没有信号的原因有哪些?如何改进?
1.试剂盒不匹配:说明书中的标明的样本种属及具体类型;检测范围和灵敏度;有的试剂盒会标明回收率及线性值
2.样本稀释度不足或过大:参考文献中对于浓度范围的描述,按说明书以及既有数据分析来稀释样本;若不清楚表达量如何,应对样本进行梯度稀释,选择最佳稀释浓度
3.样本表达量低:通过其他实验验证样本是否表达;样本中掺入标准品做对照孔,如果OD值明显升高则样本中待检物较少
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Weilai Zhou, Wenke Yuan, Yuwei Chen, Chao Li, Liwen Hu, Qidian Li, Jiawei Wang, Rou Xue, Yuan Sun, Qing Xia, Longji Hu, Yuan Wei, Miao He
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Mingrui Jiang, Guangjun Zhong, Yichao Zhu, Liuhua Wang, Yuzhe He, Qiannan Sun, Xiaoqing Wu, Xiaolan You, Sujun Gao, Dong Tang, Daorong Wang
Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2021 Jul 14 .
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