注： Lysis buffer 使用前，立刻加入 1 mM PMSF（推荐购买abs9146，自行配制）。

二、使用方法

A. 制备细胞裂解物
1. 吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基，使其在预定的时间内对细胞进行处理。
2. 收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1 X PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS 并在每个细胞板上（10 cm）加入 0.5 ml 冰预冷的 Lysis buffer，并在冰上孵育至少5分钟。
4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
6. 在 4 °C，在 14,000 x g 条件下，微量离心10分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 -80 °C。
注：细胞裂解物制备好之后，可先进行蛋白免疫印迹法检测，以此来确定细胞裂解物里存在目标蛋白。
B. 免疫沉淀法
a) 细胞裂解物预清除（可选步骤）
1. 向 500 μl（含总蛋白 200 -1000 ug）细胞裂解物中添加 5 μl Protein A 和 5 μl Protein G。
2. 在 4 °C 下，旋转孵育 30 - 60 分钟。
3. 4°C 条件下 12000g 离心1分钟，保留上清，待用。
b) 抗原抗体结合
1. 在新的离心管内加入 500 μl （含总蛋白 200 – 1000 ug）细胞裂解物（可以是预清洗后的细胞裂解物）。
2. 加入目标蛋白的单克隆/多克隆抗体（1 – 5 μg）。
3. 同时采用非特异免疫的同源抗体作为对照。
4. 在 4 °C 轻柔混合过夜。
c) 免疫复合物沉淀
1. 抗体孵育过夜后，加入 5 μl Protein A 和 5 μl Protein G。
2. 在 4 °C 温和地混匀1- 3小时或过夜。
3. 3. 12,000 g 离心1 分钟，保留沉淀。
4. 使用 0.5 ml 1*Wash buffer 清洗沉淀，12,000 g 离心1分钟，保留沉淀。
5. 重复第4步，共计清洗3次。
注：清洗，去上清的时候需要注意避免吸走填料
C. 用蛋白免疫印迹法进行分析
1. 在 20 - 40 μl 1*SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，涡旋振荡，然后再微量离心30秒，以使附着管壁的珠子和液体到管底。
2. 将样品加热至 95 - 100 °C 并持续2 - 5分钟，然后在 14,000 g下瞬时离心1分钟，取上清液。
3. 将样品（15 – 30 μl）上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
4. 用蛋白质印迹法分析样品。

本试剂盒4℃保存，1年有效。