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  • Human TNF-α ELISA Kit

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    货号： abs510006
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    检测原理：

    本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人TNF-α抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的TNF-α与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素 (Streptavidin-HRP)。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450 nm波长 (参考校正波长540 nm或570 nm) 测定吸光度值。

    检测类型：双抗夹心法

    形式：预包被96孔板

    检测样本类型：细胞上清液，血清，血浆

    上样量：100ul

    别名: APC1 protein; Cachectin; Cachetin; DIF; TNF; TNF, monocyte-derived; tnfa; tnf-a; TNFalpha; TNF-alpha; TNF-alphacachectin; TNFATNF, macrophage-derived; TNFSF1A; TNFSF2; TNFSF2TNF superfamily, member 2; tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2); tumor necrosis factor alpha; Tumor necrosis factor ligand superfamily member 2; tumor necrosis factor; tumor necrosis factor-alpha

    试剂盒组分：

    预包被96孔板、标准品、TNF-α检测抗体、稀释用缓冲液、显色液（A、B）、洗涤液、终止液、SA-HRP、封板膜和说明书一份。

    灵敏度：0.68 pg/mL

    检测范围： 15.6 - 1,000 pg/mL

    回收率范围：87%-104%

    保存方法：2-8℃

    标准曲线图

     

    背景：

    肿瘤坏死因子alpha（TNF-α），又称为cachectin和TNFSF1A，是肿瘤坏死因子超家族的原型配体。它是一个多效因子，在炎症反应、免疫系统发育、细胞凋亡和类脂代谢中起到一个中心作用。TNF-α也参与到许多病理过程，包括哮喘、克罗恩病、类风湿关节炎、神经性疼痛、肥胖症、II型糖尿病、感染性休克、自身免疫和癌症。人TNF-α是一个26 kDa的II型跨膜蛋白，由一个35个氨基酸（aa）胞内域、一个21 aa跨膜段和一个177 aa的胞外域（ECD）组成。在ECD区，人TNF-α和猕猴有97%氨基酸序列同源性，与牛、犬、棉鼠、马、猫、小鼠、猪、大鼠有71-92%的氨基酸序列同源性。它可以由多种不同细胞如免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞、肿瘤细胞表达产生。TNF-α能诱导肿瘤细胞和病毒感染细胞的裂解，并与可溶性TNF RI结合，产生下游细胞的跨膜转到信号。TACE/ADAM17可引起含有TNF-α细胞膜的脱落从而释放具有活性的TNF-α细胞因子，它是由TNF-α胞外可溶性结构构成的三聚体，分子量为55 kDa。

    TNF-α有两个受体：TNF RI和TNF RII。TNF RI分子量为55-60 kDa，表达广泛；TNF RII分子量为78-80 kDa，仅限于造血细胞表达。两者都是以同源三聚体形式表达；TNF-α和TNF RI和TNF RII结合的亲和力相似，可促进NFκB的激活 。然而，仅有TNF RI具有细胞死亡结构域，能引发细胞凋亡。这两种可溶性受体都被释放到人的血清和尿液中，并能中和TNF-α的活性。

     

    温馨提示：本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究
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      • 问 如果我的样本是组织，有推荐处理组织样本的protocol吗？
      • 答 我们的ELISA试剂盒做组织样本，具体裂解方式参考如下：
        1、裂解液配置：建议选择：组织/细胞裂解液 (多因子检测)（abs9225）裂解液，在使用前按100:1的比例加入广谱型 
              蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA，100×DMSO储液）（abs9161），配置成工作液，现配现用；
        2、称量组织，按每10mg加入100ul裂解液工作液进行裂解针对组织，利用组织处理器或者其他组织处理装置，处理
              样本，保证样本处理完全；
        3、将裂解收的样品10000-14000rpm，4℃离心10min，取上清（建议组织裂解液离心两次）；
        4、取上清做BCA总蛋白浓度测定，完成后续操作。BCA法测量蛋白浓度请参考BCA 蛋白定量试剂盒（abs9232）说明
              书；
        5、根据测定的蛋白浓度，将样本稀释成总蛋白浓度为1μg/μl左右即可进行ELISA实验（部分指标需根据预实验结果再
              行调整）。
      • 问 ELISA数据处理有专门的软件吗？
      • 答 有，可以到如下链接下载免费版软件，点击下载。
      • 问

        同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决？

      • 答

        样本保存不当，会导致多次实验结果偏差较大，样本应尽量减少反复冻融，如需多次检测，需在取样后分装保存。

      • 问

        检测样本是细胞培养上清，那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗？

      • 答

        有影响，所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。

      • 问

        请问标曲是每次都要做吗？

      • 答

        是的，每次实验，孵育时间，洗板次数等等条件均不一样，不同实验的标曲不能混用，做一次实验需要做一次标准曲线，并且用当次，同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度，才能得到准确的结果。

      • 问

         做预实验时每种要做几个复孔呀？

      • 答

        预实验视情况而定，如果整个板子孔数较为充足，建议两个复孔，如不充足，单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。

      • 问

        血清样本少量溶血，颜色稍深，对结果有影响吗？

      • 答

        会有影响，建议取样时需注意，避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限，建议用样本稀释液适当稀释，减少基质效应影响。

      • 问

        试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗？

      • 答

        试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例，但是为大致范围，最好还是根据自己的样本情况，设计预实验测量计算。

      • 问

        加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大？

      • 答

        加完终止液后，显色反应也不是永远停止，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。

      • 问

         副孔差别比较大，是没洗干净吗？

      • 答

        复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。

      • 问 配好的抗体没用完如何保存，可保存多久？预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂，剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗？
      • 答

        一般来讲，配好的母液，可以在四度保存，最多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的，间隔时间不要太长，一个月之内均可，需注意试剂避免污染，板子保持干燥。

      • 问

        最后显示的OD值在多少之间属于可用值，有要求吗？

      • 答 有的，为保证标曲的线性范围，建议最好标曲最高点OD值在0.8-3之间，同时，线性（四参数拟合）较好，副孔值CV值较低（15%以下）时，结果可用。
      • 问

        样本总是在标准曲线之外，稀释100倍也是，怎么办？

      • 答

        在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达极高的蛋白，确实会出现这种情况，建议继续提高稀释比例。

      • 问

        试剂盒推荐用450和540nm双波长检测，但条件有限可否换成450和620的双波长？如何使用校准波长？还有，用空白孔校准可以么？

      • 答

        可以的，TMB底物显色后，吸光峰值在450nm，另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置，避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值，用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法，因为避免了不同孔的读数影响，防止出现空白孔污染，导致读数较高，无法校准的情况。

      • 问

        ELISA可以检测胞内蛋白么？

      • 答

        可以的，选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。

      • 问

        爱必信的ELISA试剂盒显色液是双组份的，有些其他品牌的是单组分的，使用单组分的有影响么？

      • 答

        HRP酶标二抗的ELISA试剂盒，显色底物一般为TMB，TMB不稳定，曝光或污染氧化后会出现显色反应，导致实验背景升高，或无法使用，所以爱必信的ELISA试剂盒将显色液调整为双组份，方便稳定保存，仅在使用前混合，避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液，在使用前检测是否为无色透明，如果是正常的，对结果也没有影响，可以放心使用。

      • 问

         整个过程需要避光吗？避光需要避到什么程度呢？

      • 答 ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。
      • 问

        标准曲线在推荐的浓度下，r值为0.9，做了多次都是这样，怎么办？

      • 答

        要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，如爱必信的ELISA试剂盒，需要使用四参数拟合方式进行拟合，用错拟合方式，会导致r方值较低；如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。

      • 问

        封板膜什么时候用？每次加液后都要换吗？

      • 答

        封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

      • 问

        手动洗板过程中，拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗？

      • 答

        是需要更换的，防止造成交叉污染，影响实验结果的准确性。

      • 问

        有的wash buffer析出结晶后在37℃也不溶解，怎么办？

      • 答

        可提高至55度，并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。

      • 问

        测得的值都低于标准曲线的最低值，是什么原因，应该怎么解决？

      • 答

        基质效应导致，由于样本的基质环境相对于试剂盒中的稀释液更为复杂，可能存在部分成分抑制HRP酶活性，在样本中待测蛋白表达极低，甚至不表达的时候，OD值低于稀释液的值是存在的，按照0计算即可。首先是检查样品是否稀释倍数过高，降低稀释比，直至直接加样本原液，如还检测不出，需排查原因，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，其余待测样品表达含量低于检测下限，按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见，在健康样本中，表达含量极低。

      • 问

        因为检测限的原因，同一块ELISA板子，部分样本稀释，部分样本1:10稀释，部分1:20稀释，这样设置可行吗？结果可以比较吗？

      • 答 可以比较，不同稀释比例，是因为不同样本间的表达差异较大，只要保证稀释后的检测样品测量值准确，还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。
      • 问

        试剂盒里面有捕获抗体么？

      • 答

        即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。

      • 问

         ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？

      • 答

        根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。

      • 问

        In vivo周期长的话，不太好做预实验，怎么办？

      • 答

        In vivo造模取样后，可将样品分装，取一部分样品做ELISA预实验，剩余样品再进行正式实验；如多批次实验，操作较为一致，后续可取消预实验，根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。

      • 问

        做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢？多大是高多小是低？

      • 答

        需要根据文献推测，一般在健康人样本中，炎症因子表达很低，接近ELISA检测下限，样品无需稀释或1:1稀释即可，如已知为炎症疾病或造模样本，可参考文献，在预实验中设置1:10-100（或更高）的稀释比例，预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。

      • 问 ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机，需要如何操作？
      • 答

        实验室ELISA实验做的较多，还是建议使用洗板机洗板，效果更好，也更方便控制。如果没有洗板机，在洗板过程中，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。

      • 问

         ELISA实验中，酶标抗体识别的是哪个抗体？

      • 答

        在双抗夹心法ELISA中，酶标抗体识别的是检测抗体，对检测抗体进行识别和酶标记。

      • 问

        捕获抗体如何包被在96孔板上？

      • 答 如果选用的是即用型ELISA试剂盒，无需进行抗体包被；如果是非即用型的ELISA试剂盒，首先，要选择ELISA级别的板子，材质应为聚苯乙烯；然后用抗体包被液稀释（pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作浓度，然后每孔加100 μl稀释后的捕获抗体，室温或4℃过夜包被，然后进行洗板和封闭之后即可使用，如需长期保存，需要真空冻干后保存。
      • 问

         ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？

      • 答

        不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。

      • 问

        ELISA可以测DNA的表观么？

      • 答

        不可以，ELISA是利用免疫学原理，定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学，主要是检测DNA甲基化，可以选用ChIP技术。

      Certificate of Analysis(COA)

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