Human PD-L1/B7-H1 ELISA Kit

样本保存不当，会导致多次实验结果偏差较大，样本应尽量减少反复冻融，如需多次检测，需在取样后分装保存。

有影响，所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。

是的，每次实验，孵育时间，洗板次数等等条件均不一样，不同实验的标曲不能混用，做一次实验需要做一次标准曲线，并且用当次，同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度，才能得到准确的结果。

预实验视情况而定，如果整个板子孔数较为充足，建议两个复孔，如不充足，单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。

会有影响，建议取样时需注意，避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限，建议用样本稀释液适当稀释，减少基质效应影响。

试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例，但是为大致范围，最好还是根据自己的样本情况，设计预实验测量计算。

加完终止液后，显色反应也不是永远停止，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。

复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。

一般来讲，配好的母液，可以在四度保存，最多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的，间隔时间不要太长，一个月之内均可，需注意试剂避免污染，板子保持干燥。

在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达极高的蛋白，确实会出现这种情况，建议继续提高稀释比例。

可以的，TMB底物显色后，吸光峰值在450nm，另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置，避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值，用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法，因为避免了不同孔的读数影响，防止出现空白孔污染，导致读数较高，无法校准的情况。

可以的，选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。

要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，如爱必信的ELISA试剂盒，需要使用四参数拟合方式进行拟合，用错拟合方式，会导致r方值较低；如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。

封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

是需要更换的，防止造成交叉污染，影响实验结果的准确性。

可提高至55度，并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。

基质效应导致，由于样本的基质环境相对于试剂盒中的稀释液更为复杂，可能存在部分成分抑制HRP酶活性，在样本中待测蛋白表达极低，甚至不表达的时候，OD值低于稀释液的值是存在的，按照0计算即可。首先是检查样品是否稀释倍数过高，降低稀释比，直至直接加样本原液，如还检测不出，需排查原因，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，其余待测样品表达含量低于检测下限，按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见，在健康样本中，表达含量极低。

即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。

根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。

In vivo造模取样后，可将样品分装，取一部分样品做ELISA预实验，剩余样品再进行正式实验；如多批次实验，操作较为一致，后续可取消预实验，根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。

需要根据文献推测，一般在健康人样本中，炎症因子表达很低，接近ELISA检测下限，样品无需稀释或1:1稀释即可，如已知为炎症疾病或造模样本，可参考文献，在预实验中设置1:10-100（或更高）的稀释比例，预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。

实验室ELISA实验做的较多，还是建议使用洗板机洗板，效果更好，也更方便控制。如果没有洗板机，在洗板过程中，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。

在双抗夹心法ELISA中，酶标抗体识别的是检测抗体，对检测抗体进行识别和酶标记。

不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。

1.可能样本中有沉淀物、杂质，可以使用前先离心

2. 可能微孔板中有气泡，可以 小心用针尖挑破，注意不要划伤微孔板底部

3.可能微孔包被面被吸头划破，加液时小心操作

4.边际效应，实验之前将微孔板和试剂在室温下平衡，勿将微孔板置于温度变化太大的地方（如通风处、阳光直射处等），铝箔纸包住微孔板底部及下部外沿降低边际效

5.蒸发，各步之间，须使用封版胶密封反应板" "

1. 标准品是否按说明书推荐重溶，稀释；注意保存方法及期限

2.酶和底物不显色，进行颜色测试以判断酶及显色液是否正常工作

3.显色时间不足/孵育温度低，延长显色时间/选择最适反应温度，确保实验室温度稳定；采用恒温孵育箱注意不要叠放微孔板