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  • Human IL-1 beta ELISA Kit

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    货号: abs510002
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    abs510002-96T 现货 ¥2000.00
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    检测原理:

    本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人IL-1β抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体,经过孵育,样本中存在的IL-1β与固相抗体和检测抗体结合,形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后,加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。洗涤后,加入显色底物,避光显色。加入终止液终止反应,在450 nm波长(参考校正波长540nm570nm)测定吸光度值。

    检测类型:双抗夹心法

    形式:预包被96孔板

    检测样本类型:细胞上清液,血清,血浆

    上样量:100ul

    试剂盒组分:

    预包被96孔板、标准品、IL-1β检测抗体、稀释用缓冲液、显色液(AB)、洗涤液、终止液、SA-HRP、封板膜和说明书一份。

    灵敏度:1.0pg/mL

    检测范围: 3.9 - 250 pg/mL

    回收率范围:85-107%

    保存方法:2-8

    标准曲线图

      

    背景:

    白细胞介素-1IL-1)蛋白家族成员中包括经典的IL-1α和IL-1β。IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)、IL-18IL-33IL-1F5-F10IL-1α和IL-1β有相同的细胞表面结合受体,形式相同的生物学功能。健康人未刺激的细胞是不产生IL-1的,只有皮肤角质形成细胞、一些上皮细胞,以及中枢神经系统的某些细胞是例外。但在响应炎症因子、感染、或微生物内毒素时,IL-1在巨噬细胞和其他类型细胞表达急剧增加。IL-1β在免疫和炎症应答、骨重塑、发热、碳水化合物代谢、GH/IGF-1的生理过程中起重要作用。多种疾病与IL-1表达失调或延时表达相关,其中包括败血症、类风湿关节炎、炎性肠道疾病、急性和慢性髓细胞白血病、胰岛素依赖型糖尿病、动脉粥状硬化、神经损伤和老年退化有关的疾病。

    IL-1α和IL-1β是结构相关的多肽,在氨基酸水平约有25%的同源性。两者都是先合成为31kDa前体,然后裂解为大约17.5kDa的成熟蛋白。由Caspase-1/ICEIL-1β的前体切割是炎症反应的关键步骤。尽管IL-1α和IL-1β都不含有一个典型的疏水信号肽,但有证据表明,它们可以经非经典途径分泌到胞外。未处理的IL-1α部分可在细胞膜上展示,并可能保留生物活性。与IL-1β前体不同,IL-1β前体与成熟的IL-1β相比,具有很少或根本不具有生物活性。IL-1β前体与成熟的IL-1β都运至胞外。

    IL-1α和IL-1β通过免疫球蛋白超家族受体与IL-1RA结合发挥其效应。80kDaI型跨膜受体(IL-1RI)在多种细胞中表达,包括T细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞、滑膜衬里细胞、软骨细胞和肝细胞。68kDaII型跨膜受体(IL-1RII)在B细胞、中性粒细胞和骨髓细胞中表达。IL-1RIIL-1RII的胞外区域享有28%的同源性。但其他区域有显著不同:II型受体的胞内域只有29个氨基酸,而I型受体的胞内域有213个氨基酸。IL-1RII似乎对IL-1信号没有响应,其功能是作为诱骗受体从而削弱IL-1的作用。IL-1受体配体蛋白(IL-1RAcP)与IL-1RI相互作用是IL-1RI信号传导所必需的。IL-1RA是分泌型分子,是IL-1的竞争性抑制剂。可溶性IL-1RIIL-1RII存在于人的血浆、关节液、及几种细胞株的条件培养基中。此外,牛痘病毒编码类似于可溶性IL-1RIIIL-1结合蛋白。

    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
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      • 如果我的样本是组织,有推荐处理组织样本的protocol吗?
      • 我们的ELISA试剂盒做组织样本,具体裂解方式参考如下:
        1、裂解液配置:建议选择:组织/细胞裂解液 (多因子检测)(abs9225)裂解液,在使用前按100:1的比例加入广谱型 
              蛋白酶抑制剂混合物(不含EDTA,100×DMSO储液)(abs9161),配置成工作液,现配现用;
        2、称量组织,按每10mg加入100ul裂解液工作液进行裂解针对组织,利用组织处理器或者其他组织处理装置,处理
              样本,保证样本处理完全;
        3、将裂解收的样品10000-14000rpm,4℃离心10min,取上清(建议组织裂解液离心两次);
        4、取上清做BCA总蛋白浓度测定,完成后续操作。BCA法测量蛋白浓度请参考BCA 蛋白定量试剂盒(abs9232)说明
              书;
        5、根据测定的蛋白浓度,将样本稀释成总蛋白浓度为1μg/μl左右即可进行ELISA实验(部分指标需根据预实验结果再
              行调整)。
      • ELISA数据处理有专门的软件吗?
      • 有,可以到如下链接下载免费版软件,点击下载
      • 同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决?

      • 样本保存不当,会导致多次实验结果偏差较大,样本应尽量减少反复冻融,如需多次检测,需在取样后分装保存。

      • 检测样本是细胞培养上清,那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗?

      • 有影响,所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。

      • 请问标曲是每次都要做吗?

      • 是的,每次实验,孵育时间,洗板次数等等条件均不一样,不同实验的标曲不能混用,做一次实验需要做一次标准曲线,并且用当次,同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度,才能得到准确的结果。

      •  做预实验时每种要做几个复孔呀?

      • 预实验视情况而定,如果整个板子孔数较为充足,建议两个复孔,如不充足,单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。

      • 血清样本少量溶血,颜色稍深,对结果有影响吗?

      • 会有影响,建议取样时需注意,避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限,建议用样本稀释液适当稀释,减少基质效应影响。

      • 试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗?

      • 试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例,但是为大致范围,最好还是根据自己的样本情况,设计预实验测量计算。

      • 加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大?

      • 加完终止液后,显色反应也不是永远停止,形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深,建议在15 min内读数。

      •  副孔差别比较大,是没洗干净吗?

      • 复孔值差异较大,主要原因应考虑加样是否准确,洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。

      • 配好的抗体没用完如何保存,可保存多久?预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂,剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗?
      • 一般来讲,配好的母液,可以在四度保存,最多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的,间隔时间不要太长,一个月之内均可,需注意试剂避免污染,板子保持干燥。

      • 最后显示的OD值在多少之间属于可用值,有要求吗?

      • 有的,为保证标曲的线性范围,建议最好标曲最高点OD值在0.8-3之间,同时,线性(四参数拟合)较好,副孔值CV值较低(15%以下)时,结果可用。
      • 样本总是在标准曲线之外,稀释100倍也是,怎么办?

      • 在设置稀释倍数之前,需要参考相关文献,对于一些表达极高的蛋白,确实会出现这种情况,建议继续提高稀释比例。

      • 试剂盒推荐用450540nm双波长检测,但条件有限可否换成450620的双波长?如何使用校准波长?还有,用空白孔校准可以么?

      • 可以的,TMB底物显色后,吸光峰值在450nm,另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置,避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值,用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法,因为避免了不同孔的读数影响,防止出现空白孔污染,导致读数较高,无法校准的情况。

      • ELISA可以检测胞内蛋白么?

      • 可以的,选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可,将组织样品或细胞样品进行裂解,提取胞内蛋白后进行蛋白定量,保证每孔上样总蛋白量一致即可。

      • 爱必信的ELISA试剂盒显色液是双组份的,有些其他品牌的是单组分的,使用单组分的有影响么?

      • HRP酶标二抗的ELISA试剂盒,显色底物一般为TMBTMB不稳定,曝光或污染氧化后会出现显色反应,导致实验背景升高,或无法使用,所以爱必信的ELISA试剂盒将显色液调整为双组份,方便稳定保存,仅在使用前混合,避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液,在使用前检测是否为无色透明,如果是正常的,对结果也没有影响,可以放心使用。

      •  整个过程需要避光吗?避光需要避到什么程度呢?

      • ELISA实验中,在酶标抗体孵育,以及显色底物孵育这两步建议避光,其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹,或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。
      • 标准曲线在推荐的浓度下,r值为0.9,做了多次都是这样,怎么办?

      • 要仔细核对产品说明书,看是否用了推荐的拟合方法,如爱必信的ELISA试剂盒,需要使用四参数拟合方式进行拟合,用错拟合方式,会导致r方值较低;如拟合方式无误,需检查是否有个别标曲孔数值异常,排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。

      • 封板膜什么时候用?每次加液后都要换吗?

      • 封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是,都要盖好封板膜,减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

      • 手动洗板过程中,拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗?

      • 是需要更换的,防止造成交叉污染,影响实验结果的准确性。

      • 有的wash buffer析出结晶后在37℃也不溶解,怎么办?

      • 可提高至55度,并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。

      • 测得的值都低于标准曲线的最低值,是什么原因,应该怎么解决?

      • 基质效应导致,由于样本的基质环境相对于试剂盒中的稀释液更为复杂,可能存在部分成分抑制HRP酶活性,在样本中待测蛋白表达极低,甚至不表达的时候,OD值低于稀释液的值是存在的,按照0计算即可。首先是检查样品是否稀释倍数过高,降低稀释比,直至直接加样本原液,如还检测不出,需排查原因,建议在实验组别设置中添加阳性对照孔,用明确表达的样品作为阳性对照,如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度,则表明实验成功,其余待测样品表达含量低于检测下限,按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见,在健康样本中,表达含量极低。

      • 因为检测限的原因,同一块ELISA板子,部分样本稀释,部分样本1:10稀释,部分1:20稀释,这样设置可行吗?结果可以比较吗?

      • 可以比较,不同稀释比例,是因为不同样本间的表达差异较大,只要保证稀释后的检测样品测量值准确,还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。
      • 试剂盒里面有捕获抗体么?

      • 即用型ELISA试剂盒中,捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上,没有单独的捕获抗体提供,直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。

      •  ELISA实验中,检测计算抗原的浓度,临界值怎么确定?

      • 根据曲线测定的浓度,建议落在标准曲线的中间位置较好,极限最好不要超过标准曲线的上下限,如果超出较多,会影响计算结果准确性,建议调整稀释比例。

      • In vivo周期长的话,不太好做预实验,怎么办?

      • In vivo造模取样后,可将样品分装,取一部分样品做ELISA预实验,剩余样品再进行正式实验;如多批次实验,操作较为一致,后续可取消预实验,根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。

      • 做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢?多大是高多小是低?

      • 需要根据文献推测,一般在健康人样本中,炎症因子表达很低,接近ELISA检测下限,样品无需稀释或1:1稀释即可,如已知为炎症疾病或造模样本,可参考文献,在预实验中设置1:10-100(或更高)的稀释比例,预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。

      • ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机,需要如何操作?
      • 实验室ELISA实验做的较多,还是建议使用洗板机洗板,效果更好,也更方便控制。如果没有洗板机,在洗板过程中,需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出,在加洗板液后,静置1-2min,甩干液体后,在吸水纸上大力拍干;重复三次。

      •  ELISA实验中,酶标抗体识别的是哪个抗体?

      • 在双抗夹心法ELISA中,酶标抗体识别的是检测抗体,对检测抗体进行识别和酶标记。

      • 捕获抗体如何包被在96孔板上?

      • 如果选用的是即用型ELISA试剂盒,无需进行抗体包被;如果是非即用型的ELISA试剂盒,首先,要选择ELISA级别的板子,材质应为聚苯乙烯;然后用抗体包被液稀释(pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2PBSpH7-8Tris-HCl)成工作浓度,然后每孔加100 μl稀释后的捕获抗体,室温或4过夜包被,然后进行洗板和封闭之后即可使用,如需长期保存,需要真空冻干后保存。
      •  ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么?

      • 不是的,在双抗夹心法ELISA实验中,会同时用到捕获抗体和检测抗体,这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体,这样才可以同时结合抗原分子。

      • ELISA可以测DNA的表观么?

      • 不可以,ELISA是利用免疫学原理,定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学,主要是检测DNA甲基化,可以选用ChIP技术。

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