酵母基因组DNA快速提取试剂盒

该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统，适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。酵母细胞经lyticase处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。纯化的DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。 
菌体浓度检测：可采用分光光度计或平板培养法检测菌体量，一般对于酿酒酵母，OD600值为1.0时，相当于1-2×10⁷ cells/ml。 
产品特点：
1、重复性好：离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小。克服了膜质量不稳定的弊端。
2、提取纯度高，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。 3、简单快捷，操作安全。
自备试剂：无水乙醇、Sorbitol buffer、β-巯基乙醇
产品信息：

组分	保存	50次
缓冲液 YB	室温	20ml
结合液 CB	室温	11ml
抑制物去除液 IR	室温	25ml
漂洗液 WB	室温	15ml（第一次使用前加入 60ml 无水乙醇）
洗脱缓冲液 EB	室温	15ml
Lyticase 10U/μl	-20℃	2500U
蛋白酶 K（20mg/ml）	室温	1ml
吸附柱 AC	室温	50个
收集管（2ml）	室温	50个

提示：1、第一次使用前请先在 15ml 漂洗液 WB 中加入 60ml 无水乙醇，充分混匀，加入后 请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 2、吸取使用量的 Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。 操作：1、取酵母培养物(不超过 5×10 7 cells)，12,000rpm 离心 30 sec，尽可能的吸弃上清,收集 菌体。2、酵母细胞壁的破除: 酶法：向菌体中加入 600μl 山梨醇 buffer，加入大约 50 U Lyticase 充分混匀。30℃处理 30 min，4000rpm(~1500×g)离心 10 min，弃上清，收集沉淀。 注意：以上为 5×10 7 个酵母细胞的 Lyticase 用量，根据酵母的菌株和酵母细胞数量的 不同，所用Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。如果破壁效果不好导致DNA 产量低,可以加大 lyicase 用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间来提高效果,不适合 Lyticase 消化的酵母可选用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠涡旋,煮沸,反复冻融等 破碎细胞。 3、向沉淀中加入 180μl 缓冲液 YB 充分重悬细胞团。 如果需要去除 RNA，可加 4μl RNase A（10 mg/ml）溶液（RNA 酶客户自备），振荡 15 sec,室温放置 5 min。 4、加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。5、加入 220μl 结合液 CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置 10 min。 注意:加入缓冲液 GB 时可能会产生白色沉淀，一般 70℃放置时会消失，不会影响后续 实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取 DNA 量少和提取的 DNA 不纯。6、加 220µl 无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管 盖内壁的水珠。7、将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管 中）12,000rpm 离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液。8、加入 500μl 抑制物去除液 IR，12,000rpm 离心 30 sec，弃废液。9、加入 500μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30 sec， 弃掉废液。10、重复操作步骤 9。11、将吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放置数分 钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。12、取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 50-200μl 洗脱 缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置 2-5 min， 12,000rpm 离心 1 min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 2 min， 12,000rpm 离心 1 min。（注意:DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解）

Lyticase -20℃保存，其它试剂室温保存，有效期12个月，详细信息详见各组分清单。

1、结合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低温时可能出现析出和沉淀，可以在 37℃水浴几分 钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2、结合液 CB 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾 染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
3、为避免降低活性，方便运输，提供 Lyticase(2500U)为冻干粉状，收到后，可短暂离 心后，加入 0.25 毫升灭菌水溶解配制成 10U/μl，反复冻融可能会降低酶活性，可酌 情分装-20℃保存。
4、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化。
5、Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。配制方法:称取 182.2g 山梨醇溶于 600ml 去离子水中，加入 200ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，定容 至 1L，溶液 4℃保存。临用前加入β-巯基乙醇至 0.1% 浓度(商品化的β-巯基乙醇摩 尔浓度一般为 14M)。
6、洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱， 但应该确保批pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。 DNA 如果需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA， pH 8.0），但是 EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。