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  • 多重荧光免疫组化染色试剂盒(组合系列)
    货号: abs50032
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    abs50032-100T 1-2周 询价
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    概述
    描述
    组织微环境中有复杂的细胞组成,这些细胞的表型、状态、丰度、分布都有着重要的生物学意义和临床价值。借助抗体染色可以将其在组织原位上呈现出来。免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术,常规IHC检测只能展示单一指标,难以呈现复杂的组织微环境中的细胞组成、状态和关系,而这些信息对疾病的诊断和治疗至关重要!
    酪氨信号放大技术原理:类似常规免疫组化的DAB显色方法,TSA技术同样采用HRP标记的二抗,HRP催化加入体系的荧光素底物,生产活化荧光底物,活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合,使样品上稳定的共价结合荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的抗体,在换下一种一抗来第二轮孵育,换另一种荧光素底物,如此往复就可实现多重标记。
    产品组分:*表示可选组分,下单前需要确认备注到订单
    名  称规格(100T)保存温度激发波长(nm)发射波长(nm)
    SuperNova488(200x)*A50ul-20℃490515
    SuperNova532(200x)*B50ul527558
    SuperNova555(200x)*C50ul555565
    SuperNova594(200x)*D50ul593614
    SuperNova620(200x)*E50ul617639
    SuperNova640(200x)*F50ul642662
    SuperNova680(200x)*G50ul681698
    DAPI(100*母液)100ul2-8℃360461
    信号放大液NA  
    羊抗小鼠二抗(三选一) *HNA  
    羊抗兔二抗(三选一) *INA  
    鼠兔通用二抗(三选一)*JNA  
    抗荧光淬灭封片剂5mlx2   
    检验原理
    多重荧光免疫组化染色是基于抗原、抗体特异性结合的原理,选用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗抗体,对试剂盒中的荧光染料进行活化,将信号共价结合到抗原上。借助于不同的荧光染料标记,通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色。
    产品组成
    固定部分:信号放大反应液、抗荧光淬灭封片剂、DAPI.
    可选部分:染料和二抗自由组合
    应用
    主要用于人源或小鼠组织、石蜡切片、TMA芯片的免疫组化染色。
    使用方法
    样本要求:
    1. 福尔马林固定的蜡块或玻片,大块组织或TMA,封蜡不能有明显的破损。
    2. 玻片样本,组织需要紧贴玻片,避免褶皱,玻片不能有破损、划伤或污渍。
    3. 组织最小应包含大于1000 个细胞。
    4. 蜡块需包埋实体瘤组织,坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品会影响染色效果。
    5. 组织应当用10%中性福尔马林固定,正常固定时间为18~24 小时。
    6. 切片厚度为4um 左右,使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。
    7. 不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂,样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分,轻敲去除水滴。
    8. 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min,确保水分去除、贴片牢固。

    试剂准备:
    1) TBST 洗液:25 mM TRIS-HCl (pH 7.5),150 mM NaCl,0.05% Tween®20 (v/v)
    2) 抗原修复液:根据一抗选择柠檬酸钠或者EDTA修复液
    3) 抗体稀释液:可做抗体稀释和封闭使用,即用型
    4) 一抗工作液:现用现配,根据预实验条件优化浓度
    5) 二抗工作液:二抗工作液为HRP-羊抗鼠兔或兔双抗
    6) 荧光染料染色工作液:系列单色荧光染料为200X 母液,使用前用TSA 信号放大反应液1:
    200 稀释用配好的工作液4℃保存,仅限当天使用。
    7) DAPI 工作液:DAPI 使用无菌水按1:100稀释制备工作液

    操作步骤:建议采用实验操作表格进行记录
    1. 样品脱蜡准备:
    a) 温箱设置到55℃-60℃,烤片1h 以上。
    b) 新鲜二甲苯浸片10min,重复3 次。
    c) 梯度乙醇浸片:100% 3min;95% 3min;70% 3min。
    d) 灭菌水洗片1min,重复3 次。
    2. 多重荧光免疫组化染色步骤(A、B、C 三种抗体为例) :
    A 抗体
    A.1 抗原修复:把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min 煮沸,立刻放入切片,低火(约20%功率) 继续加热15min 后冷却至室温。进行该步骤之前建议不放样品进行一次预实验,检测15min 后液面是否高于样品,避免干片,抗原修复液不能2 次使用。
    A.2 封闭:去除玻片上残存洗液,用组化笔圈出玻片上的样本区域,滴加抗体稀释液/封闭液,覆盖样本区域, 室温孵育10min。
    A.3 一抗孵育:用抗体稀释液按照推荐比例稀释A 抗体,去除玻片上的封闭液,加一抗至完全覆盖样本,室温孵育30min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    A.4 二抗孵育:去除玻片上残存的洗液,滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体,浸没样本区域,室温孵育10min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    A.5 荧光染色放大信号:去除玻片上残存的洗液,滴加荧光染料染色工作液,室温孵育10min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    A.6 微波修复:把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min,立刻放入切片,低火(约20%功率)继续加热10min 后冷却至室温。
    B 抗体
    B.1 封闭:去除玻片上残存洗液,用组化笔圈出玻片上的样本区域,滴加抗体稀释液/封闭液,覆盖样本区域, 室温孵育10min。
    B.2 一抗孵育:用抗体稀释液按照推荐比例稀释B 抗体,去除玻片上的封闭液,加一抗至完全覆盖样本,室温孵育30min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    B.3 二抗孵育:去除玻片上残存的洗液,滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体,浸没样本区域,室温孵育10min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    B.4 荧光染色放大信号:去除玻片上残存的洗液,滴加荧光染料染色工作液,室温孵育10min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    B.5 微波修复:把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min,立刻放入切片,低火(约20%功率) 继续加热10min 后冷却至室温。
    C 抗体
    C.1 封闭:去除玻片上残存洗液,用组化笔圈出玻片上的样本区域,滴加抗体稀释液/封闭液,覆盖样本区域, 室温孵育10min。
    C.2 一抗孵育:用抗体稀释液按照推荐比例稀释C 抗体,去除玻片上的封闭液,加一抗至完全覆盖样本,室温孵育30min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    C.3 二抗孵育:去除玻片上残存的洗液,滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体,浸没样本区域,室温孵育10min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    C.4 荧光染色放大信号:去除玻片上残存的洗液,滴加荧光染料染色工作液,室温孵育10min,用1X TBST 浸洗玻片3 次,每次2 分钟。
    C.5 微波修复:把1X 碱性抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min,立刻放入切片,低火(约20%功率) 继续加热10min 后冷却至室温。
    每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况,注意用TBST 覆盖样品,防止干片。
    3. DAPI 复染及封片:
    去除玻片上残存洗液,滴加DAPI 工作液,室温孵育5min,用1X TBST 浸洗玻片2 分钟,用灭菌水洗片2 分钟, 在样品上滴加适量抗淬灭封片剂,加盖玻片,小心排除气泡,用透明指甲油封住盖玻片四周,室温晾干,4℃ 避光保存。
    4. 成像:
    选用成像设备按照染料光谱条件设置拍摄条件,对染色后的组织片在荧光显微镜下数据并进行
    判读分析。
    性能
    储存/保存方法
    荧光染料需避光保存,按说明书要求,收到货起有效期为12个月。
    注意事项
    1. 本试剂盒只用于免疫组化,不做其他用途。
    2. 本试剂盒仅限于专业人员使用。
    3. 应采用适当的防护措施,以避免试剂同皮肤和眼睛接触。
    4. 超过有效期的试剂活性可能降低,因此不得使用超过有效期的试剂。
    5. 若将本试剂盒的染色组分与其他公司的产品混合使用,在染色过程中可能出现异常情况。
    6. 脱蜡不彻底,容易影响染色效果。
    7. 为了防止可能出现的假阴性、假阳性结果,实验过程中需有阳性对照及阴性对照同时进行。
    8. 使用本试剂盒中所产生的各种废弃物都应按照《医疗废物管理条例》进行处理。
    参考文献
    参考文献
    1.Dabbs David J. 诊断免疫组织化学(M). 北京:北京大学医学出版社,2008.9.
    2.【美】Ed Harlow, David Lane. 抗体技术指南(M). 北京:科学出版社,2002:79-80,105.
    3.Stack, E. C., et al., Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods, 2014 70 (1): 46-58.
    4.钱帮国. 焦磊. 多标记免疫荧光染色及多普成像技术在组织学研究中的应用. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2017 (4): 373-382.
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
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      SuperNova680

      681

      698

      AF680/CY5.5/Opal690

      DAPI

      360

      461

      DAPI

    • 样本可以做成冰冻切片吗?
    • 可以的。抗原修复步骤不推荐用加热的方法,推荐用抗体洗脱液(abs994)
    • 所有操作要避光吗?
    • 不需要,在常规环境下操作就可以,染料的荧光强度很高。
    • 抗体修复液每一轮修复都要更换吗?
    • 是的,每一轮都要根据抗体选择相应的修复液。
    • 染料的选择会影响后染色吗,有共定位的话怎么办?
    • 共定位的情况,我们可以通过单一通道观察来更好的检测各指标的分布情况,染料不会对染色有影响,串色的情况需要预实验做充足,包括抗体稀释比例,染料与放大液比例,修复条件的确定。
    • 多色用的一二抗各是什么种属?
    • 多色的优势在于一二抗种属无需特别要求,一抗根据样本种属选择既可,二抗根据一抗选择即可,多个抗体组合,种属不会有影响。
    • 抗体洗脱和微波修复哪种方式洗脱效果更好?
    • 微波修复洗脱更稳定,抗体洗脱液对大多数抗体都管用,难洗的抗体延长洗脱时间就可以啦!
    • 实验用时真的一天能做完吗?
    • 相比普通的组织荧光实验,我们一抗的孵育时间只需室温30min,二抗和信号放大步骤只需孵育10min,能大大节约时间,五色左右可在一天内做完。
    • 多色样本的寄送有条件限制吗?
    • 正常的石蜡切片和组织芯片很稳定,只要防震盒常温运输即可,冰冻切片的话,需要干冰低温运输。
    • 我的组织还有GFP蛋白,给结果的时候能排除干扰吗?
    • 可以的,结果分析的时候可以避免绿色通道,分析软件赋予的颜色是伪彩色,可以更换其他颜色。

    • 我这边提供抗体的话,抗体需要满足什么条件吗?
    • 抗体最起码要满足IHC/IF的实验应用,各品牌供应商都会提供相应的实验验证的,爱必信组化抗体经过严格实验验证,是不错的选择。

    • 如果我能提供抗体给你们做服务的话,需要的抗体量是多少?
    • 需要的抗体量要根据样本数来,但一般来讲,50-100ul的抗体足够完成预实验+正式实验了。

    • 在指标与染料的搭配以及染色顺序上,有什么规律吗?
    • 并没有一个特别的线性关系,和蛋白的种类、表达量以及修复条件都有关系,所以会多因素考虑,多尝试,预实验很重要。
    • TSA技术原理中有抗体洗脱的步骤,但是在你们的试剂盒步骤说明中却没有?
    • 试剂盒步骤中的抗原修复过程就是抗体洗脱过程。

    • B细胞、T细胞、DC细胞常用maker能推荐下吗?
    • T细胞:CD3、CD4、CD8、FoxP3(再细化还有:GranzymeB、PD-1、TIM-3、CD45)
      B细胞:CD19 ;
      DC细胞:CD8α、CD11b

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