无内毒素高纯度质粒小量快速提取试剂盒

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过过滤柱除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：
1、离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
2、独有的去蛋白液配方，可以高效去除核酸酶。即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
3、独特内毒素清除方法，清除内毒素效果一般小于<0.1 EU/μg。
产品信息：

组分	保存	50次
平衡液 BL	室温	30ml
RNaseA（10mg/ml）	-20℃	150ul
溶液 P1	4℃	15ml
溶液 P2	室温	15ml
溶液 P3	室温	20ml
去蛋白液 PD	室温	15ml
漂洗液 WB	室温	15ml（第一次使用前加入 60ml 无水乙醇）
过滤柱 E	室温	50个
洗脱缓冲液 EB	室温	10ml
吸附柱 AC	室温	50个
收集管（2ml）	室温	50个

提示：
1、第一次使用前请先在漂洗液 WB 瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2、将 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2-8℃保存。
操作：
1、向吸附柱AC 中（吸附柱放入收集管中）加 500μl 的平衡液 BL，12,000rpm 离心 1min， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2、取 1.5-4.5 毫升过夜培养的菌液 12,000rpm 离心 30sec，尽可能的倒干上清，收集菌体。
3、用 250μl 溶液 P1 重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
4、加 250μl 溶液 P2，温和地上下翻转 4 -7 次（裂解时间不超过 5min）使菌体充分裂解。
5、加 350μl 溶液 P3，立即温和地上下翻转 4 -7 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉 淀，12,000rpm 离心 5 min。
6、将上清加入到过滤柱E中（过滤柱放入 1.5ml或2ml离心管中），12,000rpm离心2 min， 收集液体。如上清量较大，请分两次离心。
7、将上述液体转入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm 离心 30-60 sec， 倒掉管中的废液。 可选步骤: 所用菌株为 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株时，由于核酸酶 含量丰富， 应加入 500μl 去蛋白液 PD，12,000rpm 离心 30-60 sec，弃废液。
8、加入 500μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30-60 sec 弃掉废液。
9、重复步骤 8。
10、将吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放置数 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11、取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，室温放几分钟。
12、在吸附膜的中间部位加 50μl-100μl 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴 中加热效果更好），室温放置 2 min，12,000rpm 离心 1 min。如果需要较多量质粒， 可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心 1 min。(注意：若用 ddH2O 做洗脱液， 应保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围内，pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体 积不应少于 50 μl，体积过 小影响回收效率。且 DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。)

参考试剂盒说明书，有效期18个月。

1、第一次使用时，将试剂盒所带的全部 RNase A 加入溶液 P1 后（终浓度 100ug/ml） 置于 4℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的质粒可能会有微量 RNA 残留， 在溶液 P1 中补加 RNase A 即可。
2、环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几 分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化。
4、溶液 P3 和去蛋白液 PD 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5、提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒建议接种单菌落于 1.5-4.5ml 加合适抗生素的 LB 培养基，过夜培养 14-16 个小时，可提取 出多达 20µg 的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒，应适 当加大菌体使用量，使用 5-10ml 过夜培养物，同时按比例增加 P1、P2、P3 的用量，其它步骤相同。
6、得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为 1 相当于大约 50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为 2 条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间 长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 90%。
7、质粒 DNA 确切分子大小，必须酶切线性化后，对比 DNA 分子量 Marker 才可以知道。处于环状或者超螺旋的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。