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  • 双链RNA(dsRNA)ELISA检测试剂盒(J2)

    • Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based);Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based)
    货号: abs590003
    产品说明书
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    abs590003-96T 缺货 ¥5500.00
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    概述
    别名
    Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based)
    检验原理
    夹心ELISA
    形式
    试剂盒
    产品组成
    J2单抗包被Microplate,K2检测抗体,dsRNA标准品,HRP酶标二抗,TMB显色液,终止液,封板膜等。
    使用方法
    详见随货说明书。
    背景说明
    基于使用两种双链 RNA (dsRNA) 特异性单克隆抗体,dsRNA 检测试剂盒可以灵敏和选择性地检测 dsRNA 分子(大于 30-40 bp),而不受其核苷酸组成和序列的影响。检测具有高度特异性:在存在 1.000-10.000 倍过量其他核酸的情况下,可以检测核酸提取物中的 dsRNA。该测定基于夹心 ELISA 原理,并使用 J2 (IgG2a) 小鼠单克隆抗体对 dsRNA 作为捕获抗体。单克隆抗体 K2 (IgM) 用作检测抗体。J2抗dsRNA IgG2a单克隆抗体已成为dsRNA检测的金标准。它最初用于植物病毒的研究,但自从 Weber 等人的开创性论文以来。2006 年,J2 被用来证明所有测试的正链 RNA 病毒在受感染的细胞中产生大量的 dsRNA,这种抗体已广泛用于各种系统,如 200 多篇科学出版物所述。J2 可用于检测多种病毒的 dsRNA 中间体,如丙型肝炎病毒、登革热病毒、鼻病毒、基孔肯雅病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、猪瘟病毒、Brome 花叶病毒以及更多存在于培养细胞和固定石蜡包埋的组织学样品中。
    性能
    储存/保存方法
    整个试剂盒储存在 -20ºC 下。试剂盒解冻后,可将其在 4ºC 下保存 5 天。对于长期储存,建议在 –20ºC 下分装并冷冻抗体和 dsRNA 成分。
    产品用途
    本试剂盒可检测核酸提取物中的病毒 dsRNA 或非病毒来源的大型天然或合成 dsRNA,以及检测人工合成 (m)RNA 制剂中是否存在不需要的 dsRNA 分子。
    注意事项
    本产品仅供研究和体外测试使用,不适用于涉及人类或动物的诊断或治疗程序。
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
    • 实验方法 实验条件
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      • ELISA数据处理有专门的软件吗?
      • 有,可以到如下链接下载免费版软件,点击下载
      • 同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决?

      • 样本保存不当,会导致多次实验结果偏差较大,样本应尽量减少反复冻融,如需多次检测,需在取样后分装保存。

      • 检测样本是细胞培养上清,那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗?

      • 有影响,所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。

      • 请问标曲是每次都要做吗?

      • 是的,每次实验,孵育时间,洗板次数等等条件均不一样,不同实验的标曲不能混用,做一次实验需要做一次标准曲线,并且用当次,同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度,才能得到准确的结果。

      •  做预实验时每种要做几个复孔呀?

      • 预实验视情况而定,如果整个板子孔数较为充足,建议两个复孔,如不充足,单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。

      • 血清样本少量溶血,颜色稍深,对结果有影响吗?

      • 会有影响,建议取样时需注意,避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限,建议用样本稀释液适当稀释,减少基质效应影响。

      • 试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗?

      • 试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例,但是为大致范围,最好还是根据自己的样本情况,设计预实验测量计算。

      • 加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大?

      • 加完终止液后,显色反应也不是永远停止,形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深,建议在15 min内读数。

      •  副孔差别比较大,是没洗干净吗?

      • 复孔值差异较大,主要原因应考虑加样是否准确,洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。

      • 配好的抗体没用完如何保存,可保存多久?预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂,剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗?
      • 一般来讲,配好的母液,可以在四度保存,最多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的,间隔时间不要太长,一个月之内均可,需注意试剂避免污染,板子保持干燥。

      • 最后显示的OD值在多少之间属于可用值,有要求吗?

      • 有的,为保证标曲的线性范围,建议最好标曲最高点OD值在0.8-3之间,同时,线性(四参数拟合)较好,副孔值CV值较低(15%以下)时,结果可用。
      • 样本总是在标准曲线之外,稀释100倍也是,怎么办?

      • 在设置稀释倍数之前,需要参考相关文献,对于一些表达极高的蛋白,确实会出现这种情况,建议继续提高稀释比例。

      • 试剂盒推荐用450540nm双波长检测,但条件有限可否换成450620的双波长?如何使用校准波长?还有,用空白孔校准可以么?

      • 可以的,TMB底物显色后,吸光峰值在450nm,另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置,避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值,用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法,因为避免了不同孔的读数影响,防止出现空白孔污染,导致读数较高,无法校准的情况。

      • ELISA可以检测胞内蛋白么?

      • 可以的,选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可,将组织样品或细胞样品进行裂解,提取胞内蛋白后进行蛋白定量,保证每孔上样总蛋白量一致即可。

      • 爱必信的ELISA试剂盒显色液是双组份的,有些其他品牌的是单组分的,使用单组分的有影响么?

      • HRP酶标二抗的ELISA试剂盒,显色底物一般为TMBTMB不稳定,曝光或污染氧化后会出现显色反应,导致实验背景升高,或无法使用,所以爱必信的ELISA试剂盒将显色液调整为双组份,方便稳定保存,仅在使用前混合,避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液,在使用前检测是否为无色透明,如果是正常的,对结果也没有影响,可以放心使用。

      •  整个过程需要避光吗?避光需要避到什么程度呢?

      • ELISA实验中,在酶标抗体孵育,以及显色底物孵育这两步建议避光,其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹,或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。
      • 标准曲线在推荐的浓度下,r值为0.9,做了多次都是这样,怎么办?

      • 要仔细核对产品说明书,看是否用了推荐的拟合方法,如爱必信的ELISA试剂盒,需要使用四参数拟合方式进行拟合,用错拟合方式,会导致r方值较低;如拟合方式无误,需检查是否有个别标曲孔数值异常,排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。

      • 封板膜什么时候用?每次加液后都要换吗?

      • 封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是,都要盖好封板膜,减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

      • 手动洗板过程中,拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗?

      • 是需要更换的,防止造成交叉污染,影响实验结果的准确性。

      • 有的wash buffer析出结晶后在37℃也不溶解,怎么办?

      • 可提高至55度,并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。

      • 测得的值都低于标准曲线的最低值,是什么原因,应该怎么解决?

      • 基质效应导致,由于样本的基质环境相对于试剂盒中的稀释液更为复杂,可能存在部分成分抑制HRP酶活性,在样本中待测蛋白表达极低,甚至不表达的时候,OD值低于稀释液的值是存在的,按照0计算即可。首先是检查样品是否稀释倍数过高,降低稀释比,直至直接加样本原液,如还检测不出,需排查原因,建议在实验组别设置中添加阳性对照孔,用明确表达的样品作为阳性对照,如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度,则表明实验成功,其余待测样品表达含量低于检测下限,按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见,在健康样本中,表达含量极低。

      • 因为检测限的原因,同一块ELISA板子,部分样本稀释,部分样本1:10稀释,部分1:20稀释,这样设置可行吗?结果可以比较吗?

      • 可以比较,不同稀释比例,是因为不同样本间的表达差异较大,只要保证稀释后的检测样品测量值准确,还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。
      • 试剂盒里面有捕获抗体么?

      • 即用型ELISA试剂盒中,捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上,没有单独的捕获抗体提供,直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。

      •  ELISA实验中,检测计算抗原的浓度,临界值怎么确定?

      • 根据曲线测定的浓度,建议落在标准曲线的中间位置较好,极限最好不要超过标准曲线的上下限,如果超出较多,会影响计算结果准确性,建议调整稀释比例。

      • In vivo周期长的话,不太好做预实验,怎么办?

      • In vivo造模取样后,可将样品分装,取一部分样品做ELISA预实验,剩余样品再进行正式实验;如多批次实验,操作较为一致,后续可取消预实验,根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。

      • 做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢?多大是高多小是低?

      • 需要根据文献推测,一般在健康人样本中,炎症因子表达很低,接近ELISA检测下限,样品无需稀释或1:1稀释即可,如已知为炎症疾病或造模样本,可参考文献,在预实验中设置1:10-100(或更高)的稀释比例,预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。

      • ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机,需要如何操作?
      • 实验室ELISA实验做的较多,还是建议使用洗板机洗板,效果更好,也更方便控制。如果没有洗板机,在洗板过程中,需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出,在加洗板液后,静置1-2min,甩干液体后,在吸水纸上大力拍干;重复三次。

      •  ELISA实验中,酶标抗体识别的是哪个抗体?

      • 在双抗夹心法ELISA中,酶标抗体识别的是检测抗体,对检测抗体进行识别和酶标记。

      • 捕获抗体如何包被在96孔板上?

      • 如果选用的是即用型ELISA试剂盒,无需进行抗体包被;如果是非即用型的ELISA试剂盒,首先,要选择ELISA级别的板子,材质应为聚苯乙烯;然后用抗体包被液稀释(pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2PBSpH7-8Tris-HCl)成工作浓度,然后每孔加100 μl稀释后的捕获抗体,室温或4过夜包被,然后进行洗板和封闭之后即可使用,如需长期保存,需要真空冻干后保存。
      •  ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么?

      • 不是的,在双抗夹心法ELISA实验中,会同时用到捕获抗体和检测抗体,这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体,这样才可以同时结合抗原分子。

      • ELISA可以测DNA的表观么?

      • 不可以,ELISA是利用免疫学原理,定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学,主要是检测DNA甲基化,可以选用ChIP技术。

      • 高背景的原因有哪些?如何改进?
      • 1、手动洗涤时请勿将洗涤液溢出孔外/检查洗板机是否正常工作,调节洗板机“洗涤量”、“洗涤循环”和“抽吸”等参数; 2、封闭的时间和温度是否适当,更换封闭buffer 3、检查底物在使用前是否曝光了,孵育底物过程微孔板是否曝光 4、检查是否按说明书稀释底物 5、加终止液三分钟后即读数
      • 重复性差的原因有哪些?如何改进?
      • 1.可能样本中有沉淀物、杂质,可以使用前先离心 2. 可能微孔板中有气泡,可以 小心用针尖挑破,注意不要划伤微孔板底部 3.可能微孔包被面被吸头划破,加液时小心操作 4.边际效应,实验之前将微孔板和试剂在室温下平衡,勿将微孔板置于温度变化太大的地方(如通风处、阳光直射处等),铝箔纸包住微孔板底部及下部外沿降低边际效 5.蒸发,各步之间,须使用封版胶密封反应板
      • 标曲做不出来的原因有哪些?如何改进?

      • 1.可能样本中有沉淀物、杂质,可以使用前先离心

        2. 可能微孔板中有气泡,可以 小心用针尖挑破,注意不要划伤微孔板底部

        3.可能微孔包被面被吸头划破,加液时小心操作

        4.边际效应,实验之前将微孔板和试剂在室温下平衡,勿将微孔板置于温度变化太大的地方(如通风处、阳光直射处等),铝箔纸包住微孔板底部及下部外沿降低边际效

        5.蒸发,各步之间,须使用封版胶密封反应板" "

        1. 标准品是否按说明书推荐重溶,稀释;注意保存方法及期限

        2.酶和底物不显色,进行颜色测试以判断酶及显色液是否正常工作

        3.显色时间不足/孵育温度低,延长显色时间/选择最适反应温度,确保实验室温度稳定;采用恒温孵育箱注意不要叠放微孔板

      • 没有信号的原因有哪些?如何改进?

      • 1.试剂盒不匹配:说明书中的标明的样本种属及具体类型;检测范围和灵敏度;有的试剂盒会标明回收率及线性值

        2.样本稀释度不足或过大:参考文献中对于浓度范围的描述,按说明书以及既有数据分析来稀释样本;若不清楚表达量如何,应对样本进行梯度稀释,选择最佳稀释浓度

        3.样本表达量低:通过其他实验验证样本是否表达;样本中掺入标准品做对照孔,如果OD值明显升高则样本中待检物较少

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