试剂盒组分：

组分	名称	规格
A	DNA纯化柱	50 tubes
B	储液管	2×25 tubes
C	连接器	50 tubes
D	收集管	2×50 tubes
E	蛋白酶K	2×1.35ml
F	Buffer PL	135ml
G	Buffer W1（浓缩液）	41ml
H	Buffer W2（浓缩液）	20ml
I	Buffer ES	10ml

自备试剂：无水乙醇、异丙醇、PBS或生理盐水
自备仪器及耗材：
1、台式离心机（适用1.5 mL离心管，离心力可达13000g以上）
2、离心机（适用15 mL离心管，离心力可达2500g以上）
3、水浴锅
4、真空泵
5、真空收集器（推荐使用QIAGEN公司的QIAvac 24 Plus vacuum manifold，货号：19413）
6、干净1.5 mL离心管

一、游离DNA提取前准备工作：
1、样本准备：
本试剂盒可用于提取2 mL血浆中的游离DNA， 如果血浆体积不足2 mL，则用缓冲液PBS或生理盐水补齐至2 mL。
2、试剂准备：
Buffer W1（浓缩液），使用前需补加25 mL无水乙醇，充分混匀，并在瓶上作好标记。
Buffer W2（浓缩液），使用前需补加80 mL无水乙醇，充分混匀，并在瓶上作好标记。

二、游离DNA提取操作步骤：
1、血浆样本准备好后，小心转移至15 mL离心管。
2、分别向15 mL离心管加入2 mL Buffer PL（1×血浆样本体积）和40ul蛋白酶K溶液，然后颠倒混匀15 ~ 20次，确保充分混匀（需注意拧紧盖子，防止后续孵育过程液体渗出，造成样本交叉污染）。
3、放置水浴锅中，56 ℃ 孵育30分钟，注意水浴锅的水位应高于15 mL离心管中液面。
4、在上述步骤孵育过程中，将真空泵和真空收集器连接好，然后根据样本数将相应的连接器插入真空收集器的小孔中，再依次插上DNA纯化柱和储液管，DNA纯化柱收集管留着备用，整个装置确保紧密连接不漏气（取出DNA纯化柱后，需将包装剩余DNA纯化柱的自封袋密封严实，防止温湿度剧烈变化而导致DNA得率的降低）。
5、步骤3结束后将样本取出，在25 ℃条件下2500g离心10秒钟。加入1 mL异丙醇然后颠倒混匀15 ~ 20次，一定要确保充分混匀，在25℃，2500g离心10秒钟(加入异丙醇后，不需要置于冰水浴中孵育)。
6、短暂离心后，小心将裂解后样本转入已连接好的储液管中，打开真空泵，将负压控制在 - 0.08 MPa～- 0.1 MPa范围内，使液体平缓流过DNA纯化柱，整个过程应观察有无液体渗漏，防止损失和交叉污染。
7、待所有液体穿过DNA纯化柱后，关真空泵，小心将储液管拆下并丢弃。
8、保持DNA纯化柱开盖状态，加入600ul Buffer W1，开真空泵，待所有液体流过DNA纯化柱，关真空泵。
9、重复步骤8。
10、保持DNA纯化柱开盖状态，加入800ul Buffer W2，开真空泵，使所有液体流过DNA纯化柱，关真空泵。
11、保持DNA纯化柱开盖状态，然后小心的将DNA纯化柱拆下并放入步骤4留下的收集管中，加入800ul Buffer W2，盖紧盖子，颠倒2 ~ 3次后，25 ℃，13000g离心1分钟。
12、将上述步骤DNA纯化柱取出，转入新收集管，在25 ℃，13000g离心3分钟。
13、将DNA纯化柱小心取出，转入新收集管，然后小心揭开纯化柱盖子，向纯化柱中央加入50 ~ 100ul Buffer ES（提取多个样本时，每个样本加入Buffer ES后需更换滤芯枪头，防止样本的交叉污染），室温放置3分钟。
14、13000g离心1分钟，收集到的液体即为提取后的血浆游离DNA，将DNA样本转入1.5 mL离心管中。如果24小时内需要使用样本，2 ~ 8℃保存即可，长期保存需放置于低于 -15℃冰箱中。

三、血浆核酸沉淀纯化 :无需沉淀

本试剂盒除蛋白酶K外，应储存于室温，干燥阴凉处，有效期为12个月。 蛋白酶K溶液储存于-20℃，可根据需要分装保存，避免反复冻融。

本试剂盒可从血浆中高效提取高纯度游离DNA（cell-free DNA），用于后续相关PCR、next-generation sequencing（NGS）等分子生物学检测。

1、使用本产品前应仔细阅读说明书。
2、试剂盒中组份Buffer PL和Buffer W1（浓缩液）含有胍盐等有害物质，操作时需做好安全防护工作。
3、试剂盒中组份Buffer PL 和 Buffer W1(浓缩液)中若发现少许颗粒物，不影响使用。
4、试剂盒使用前应确保Buffer W1（浓缩液）和Buffer W2（浓缩液）已补加相应体积的无水乙醇，不能用70%乙醇替代，并充分混匀。
5、核酸洗脱液Buffer ES不建议用纯水替代。
6、建议洗脱体积为50 ~ 100 μL，洗脱体积不能低于30 μL，当用30 ~ 50 μL洗脱时，需保证洗脱液加到吸附柱的正中央，当低于50 μL洗脱时，可能导致回收率偏低。

Circulating Cell-free DNA Isolation Kit