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  • 人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒

    货号: abs9455
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    abs9455-100mL 1-2周 ¥2750.00
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    产品描述
    描述
    间充质干细胞(MSC)具有多向分化的潜能,体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会(ISCT)确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目,目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中,成骨、成脂、成软骨也是必检指标。
            为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定,爱必信生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒,在稳定性、易用性上大幅改进,采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途,首先,用于鉴定人MSC是否具有成骨分化能力,满足MSC质量控制的要求。其次,在再生医学和组织工程研究中,诱导培养基也可作为除支架以外的培养培养体系。另外,诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测,如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、胶原含量检测、免疫组化检测等。
    组分:
    序号名称数量储存
    A人间充质干细胞成软骨诱导基础培养基100ml2-8℃
    B成软骨诱导添加物B200ul-20℃
    C成软骨诱导添加物C10ul-20℃
    D成软骨诱导添加物D100ul-20℃
    E阿利新蓝染色液5ml2-8℃

    产品特点:
    小包装。采用100ml装,使用更节约、更方便;
    简约装,升级产品、组成更简洁、操作更方便;
    更稳定,产品系统误差更小,使用更稳定。
    适用细胞类型:
    人源间充质干细胞,组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、羊膜、皮肤、牙髓、脐带血、外周血等。
    使用方法
    一、实验准备:
    1、试剂配制:
    预混液:室温融化添加物B和添加物C,将融化后加入A液,充分混匀,配制成软骨分化培养基预混液。
    注意:添加物解冻后旋涡混匀、1000 g短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入A液后,吸取A液洗涤溶液瓶两次,将洗涤液加入A液中。预混液必须充分混匀,2-8 ℃保存。
    诱导完全培养基:取10 ml预混液置于15 ml离心管中,加入一支添加物D,充分混匀制成诱导完全培养基,此液现配现用。1 ml预混液需加入添加物D的量为10 μl。
    注意:诱导完全培养基现配现用,2-8 ℃放置不得超过72小时。整个过程须确保无菌操作,各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。
    2、自备试剂:
    (1)消化液(0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 )
    (2)磷酸盐缓冲液(DPBS)
    (3)MSC完全培养基
    (4)4%中性多聚甲醛溶液
    注意:若MSC完全培养基不含血清,则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度,建议稀释0.25%胰酶消化液一倍,且严格控制消化时间。
    二、操作步骤:
    1、准备所需诱导分化的MSC,当细胞融合达85%左右时,用消化液消化细胞,细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。
    2、220 g离心5 分钟,沉淀以预混液重悬,细胞密度约2×106 cells/ml,再次离心,弃上清。
    3、沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮,调整细胞密度为2×106 cells/ml。
    4、分别取500 μl细胞悬液接种于15 ml离心管中,220 g离心5 分钟。
    注意:每管细胞的总数在5×105至1×106之间,一般以1个T25细胞培养瓶接种一个软骨球为佳,细胞数过少形成的软骨团块较小,细胞数过多则可能会分开成块。正常情况下可形成1-2 mm3的团块。离心以细胞聚团为准,可适当调整。离心力过大,软骨球不易悬浮,离心力过小则可能形成软骨球效果不佳。
    5、旋松离心管盖,将离心管轻轻竖直置于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养。
    注意:24 小时内避免摇动细胞沉淀,以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。
    6、诱导培养24 小时后,轻轻拨动离心管底,使细胞沉淀团块悬浮,重新放回培养箱继续培养。
    注意:细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定,基本在24-48 小时之间,以细胞团周围有聚拢现象时为准。若细胞团块贴壁较牢固,可用移液器轻轻吹动使其悬浮,注意不要吹散团块。
    7、每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸去旧培养基,每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500 μl。
    注意:换液时动作轻柔,以免吸出细胞团块;诱导完全培养基必须经过复温,否则影响诱导效果。在诱导培养2-3周后会出现大量细胞外基质,富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。
    8、诱导培养14-20天,弃去培养上清,DPBS洗细胞两次,4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。
    注意:培养结束时或中途可以选择其他检测方法,如基因表达检测等,若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。一般软骨球诱导致密后能进行染色处理,时间在14-20天左右,时间过久可能导致团块内部出现空泡,甚至团块裂开,具体时间请以自己细胞的特性自行确定。
    9、弃去固定液,DPBS洗2次,脱水、石蜡包埋后切片。
    注意:脱水包埋可以用擦镜纸包裹后使用自动脱水机脱水、包埋,也可以在原离心管中逐级更换脱水、透蜡的液体,手工包埋。过程中一定注意团块不要丢失。
    10、阿利新蓝染色:将切片进行脱腊和复水,阿利新蓝染液染色30 分钟,流水冲洗5 分钟,脱水、透明、中性树胶封片,显微镜下观察、拍照。
    注意:染色和制片过程中避免干片,干片后会导致组织形态发生变化,影响观察、拍照效果。根据需要可以选择细胞核复染,不建议苏木素复染,可以使用核固红复染。
    11、结果判定:按照程序操作完毕,低倍镜下观察可见蓝色着色,该蓝色染色的为酸性粘多糖,说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则,所使用的MSC无成软骨能力。
    注意:该鉴定方法和判定标准为定性实验标准,可根据具体情况设置其他判定方法和标准。以上提供的是包埋切片染色的方案,若实验室条件限制,可选择直接对团块进行染色,方法见B9、B10、B11。若试剂盒用于组织工程软骨诱导,可作为除支架材料以外的诱导液使用。
    B9、弃去固定液,DPBS洗团块2次。
    B10、阿利新蓝染色:向团块中加500 μl阿利新蓝染液染色30 分钟。弃染色液,加纯水5 ml摇动清洗5分钟/次,反复洗5次。
    注意:染色液中的团块不易看清,务必小心吸去上清,避免样本丢失。
    B11、结果判定:按照程序操作完毕,低倍镜下观察可见深蓝色着色,该蓝色染色的为酸性粘多糖,说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则,所使用的MSC无成软骨能力。
    储存/保存方法
    组分A、E于2-8 ℃避光保存,组分B、C、D于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温,各组分在所需要的温度下有效期为1年,配制完成的预混液于2-8 ℃保存,有效期1个月,完全培养基现配现用,2-8 ℃保存不超过72 小时。
    人间充质干细胞成软骨诱导检测1
    人间充质干细胞成软骨诱导检测2
    温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究
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