| 产品描述 | |
| 描述 | 爱必信的快速内切酶是一系列经过基因工程重组、能够在5~15分钟内精确完成DNA切割的限制性内切酶，适用于质粒DNA、PCR产物或基因组DNA等的快速酶切。爱必信的快速内切酶具有如下特点：5~15分钟内即可完成酶切；共用一种酶切Buffer，大大简化酶切反应体系；良好的酶活冗余度，轻松应对底物过量或困难模板酶切。此外，爱必信生物去磷酸化、连接试剂在配套的Buffer中具有100%活性，支持一管化反应，提升“酶切-修饰-连接”的体验。 识别位点： 5'...G G ↓ C G C G C C...3' 3'...C C G C G C ↑ G G...5' 同裂酶：PalAI, SgsI 注：同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性。 产品组分：| 名称 | 规格 | | AscI | 50 μl | | 10× Cut Buffer | 1 ml | | 10× Cut Color Buffer | 1 ml |
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| 使用方法 | 1. DNA 快速酶切流程
① 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系： | | 质粒 DNA | PCR 产物 | 基因组 DNA | | ddH2O | 15 μl | 16 μl | 30 μl | | 10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer | 2 μl | 3 μl（a） | 5 μl | | 底物 DNA | 2 μl (up to 1 μg) | 10 μl (~0.2 μg) | 10 μl (5 μg) | | AscI | 1 μl | 1 μl | 5 μl | | Total | 20 μl | 30 μl | 50 μl |
a. 本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度，10× Cut Buffer 加入量可适当减少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对 PCR 产物进行纯化。 ② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴； ③ 37℃温育 15 min（质粒），或 15~30 min（PCR 产物），或 30~60 min（基因组 DNA）； ④ 80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应（可选）。 2. 双酶切或多酶切： ① 每种快速内切酶的用量为 1 μl，并根据需要适当扩大反应体系； ② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10； ③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。 3. 适用于质粒的扩大反应体系： | DNA | 1 μg | 2 μg | 3μg | 4 μg | 5 μg | | Ascl | 1 μl | 2μl | 3 μl | 4 μl | 5 μl | | 10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer | 2 μl | 2 μl | 3 μl | 4 μl | 5 μl | | Total | 20 μl | 20 μl | 30 μl | 40 μl | 50 μl |
注：如果总反应体系大于 20 μl，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。 不同 DNA 中的酶切位点数量： | λDNA | ΦX174 | pBR322 | pUC57 | pUC18/19 | SV40 | M13mp18/19 | Adeno2 | | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 |
甲基化修饰影响： | Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI | | 无影响 | 无影响 | 序列可能重叠剪切阻断 | 无影响 | 无影响 |
在不同反应缓冲液中的活性： | | Cut Buffer | Thermo Scientific
FastDigest Buffer | NEB
CutSmart®
Buffer | Takara
QuickCut™ Buffer | | 活性 | 100% | 100% | 100% | 100% |
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| 储存/保存方法 | -20℃，有效期2年。 |
| 技术指标 | 建议反应条件：
1× Cut 缓冲液；
37℃温育；
参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。
失活条件：
80℃温育 20 min。
质量控制：
功能活性检测：
最适反应温度下，在 20 μl 反应体系中，1 μl AscI 能够在 15 min 内完全消化 1 μg λDNA (HindIII digest)。
超长时间温育检测：
最适反应温度下，将 1 μl AscI 与 1 μg λDNA (HindIII digest) 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解，延时酶切可能出现星号活性。
酶切 - 连接 - 再酶切检测：
最适反应温度下，使用 1 μl AscI 消化底物，回收酶切产物，在 22℃下使用适量 Fast T4 DNA Ligase 可以将酶切产物重新连接，将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。
非特异性内切酶活性检测：
最适反应温度下，将 1 μl AscI 与 1 μg 超螺旋质粒DNA 共同温育 4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒 DNA 仍然处于超螺旋状态。
蓝白斑检测：
将含有单一 lacZα 基因的载体以 1 μl AscI 消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、IPTG和 X-gal 的 LB 培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即 DNA 末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于 爱必信的系列限制酶而言，白色菌落比例应小于 1%。 |
| 温馨提示：本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究 |
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