背景：95% 阿尔茨海默病为散发性 AD (sAD)，无明确致病基因突变；现有模型多针对家族性 AD (fAD)，动物与人物种差异巨大，导致大量临床转化失败。

文章模型：构建同时包含神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管网络的人多能干细胞 (hPSC) 来源血管化神经免疫类器官；用 sAD 病人脑提取液“种子诱导”，仅4周即可复现全套 AD 核心病理，并可用于药效与副作用评估。

一、hPSC诱导三种祖细胞，共组装构建类器官

诱导流程及鉴定结果

1) NPC 神经祖细胞
· 方法：hPSC 拟胚体EB，SMAD双抑制诱导神经分化；分离神经玫瑰花环，扩增得到NPC。
· 标志物：PAX6、NESTIN。

2) PMP 原始巨噬细胞祖细胞（小胶质细胞前体）
· 方法：hPSC诱导卵黄囊样EB，BMP4/VEGF/SCF诱导中胚层造血；培养基添加IL‑3、M‑CSF，上清收获PMP。
· 标志物：CD235、CD43。

3) VP 血管祖细胞
· 方法：hPSC聚集体CHIR+BMP4诱导中胚层；VEGF+forskolin诱导血管谱系；基质胶出芽后消化为单细胞 VP。

4) 类器官共组装
· 细胞接种数量：NPC 30000个 + PMP 12000个 + VP 7000个，共培养自发聚集形成球体。
· 增殖阶段（Progression stage）需要5天时间，采用混合培养基（NPC 培养基 + PMP 培养基），加入 bFGF，促进细胞增殖。
· 分化阶段（Differentiation stage，长期培养） 换分化ND培养基：BDNF、GDNF、抗坏血酸、c‑AMP、IL‑34、M‑CSF、TGF‑β1；支持神经元、小胶质、血管同步成熟。
· 后续疾病造模时间点：分化第 10 天，加入 sAD 患者脑提取液处理 2 天；分别在暴露后 2 周、4 周收样检测病理。

二、类器官全套鉴定实验

1. 血管结构鉴定

· GFP 标记 hESC 来源 VP，活细胞成像：D12 可见分支状血管网络；切片可见管腔样结构。
· 免疫荧光：
CD31：内皮细胞标记；
Collagen IV：血管基底膜；
PDFRβ：周细胞，证明同时产生内皮 + 周细胞，构建功能性血管单元。

2. 早期神经结构

· PAX6（神经祖细胞）+ βIII‑tubulin（未成熟神经元）染色；可见脑室区样神经玫瑰花环结构，模拟发育中大脑皮层增殖区。

3. 小胶质细胞鉴定

· CD45（造血细胞通用标记）：广泛分布于类器官内部；
· CD45 + IBA1 共染：细胞呈分支形态，证明 PMP 分化得到形态正常、驻留的小胶质细胞。

4. 神经元与星形胶质细胞成熟

· MAP2：树突标记，证明大量神经元产生；
· NeuN（成熟神经元）+ S100β（星形胶质细胞）共染：同时存在成熟神经元与星形胶质细胞。

三、疾病造模与全套病理表型

造模策略：不用基因突变，用Braak V‑VI期散发性AD死者颞叶皮层脑提取液（含Aβ、tau 朊病毒样种子）；对照组：缓冲液、健康老人脑提取液。处理 2 天，2周、4周取材。

1. Aβ 淀粉样病理

· 2 周：AD 组出现神经元内 Aβ 聚集（6E10、MOAB‑2 特异性胞内 Aβ 抗体）；对照组无聚集
· 4 周：AD 组出现胞外斑块样聚集体6E10 /4G8/Aβ42 共染色；Thioflavin‑S（识别 β 折叠淀粉样物质）与 6E10 共定位，证明是淀粉样斑块样结构。
· 定量：6E10、4G8 阳性面积显著升高；健康脑提取液处理不会产生病理。

2. Tau 缠结病理

· AT8（磷酸化 tau）：2 周神经元内点状聚集；4 周大量致密缠结样聚集。
· 多重验证：
AT8 + pThr217（临床 AD 诊断 tau 位点）共染；
AT8 + Thioflavin‑S 共定位；
Gallyas 银染（金标准 tau 缠结染色），观察胞内神经原纤维缠结 NFT 样结构。

3. 神经炎症、小胶质异常突触修剪

· qPCR：促炎因子IL‑6、CCL2 mRNA 显著上调，复现神经炎症。
· 3D 重构 IBA1+6E10：小胶质可以吞噬 Aβ（生理清除功能）。
· CD45（小胶质）+ Homer1（突触后标记）三维重建：AD 组小胶质过度吞噬突触；定量 Homer1 突触 puncta 在小胶质内体积显著升高——复现 AD 中小胶质异常突触修剪。

4. 突触丢失、神经元死亡、神经网络功能受损

· Homer1突触染色：AD 组突触数量显著下降，突触丢失。
· 活化 Caspase‑3 染色：凋亡神经元比例上升，神经元死亡增加。
· MEA 多电极阵列功能检测：类器官接种 MEA 芯片；AD 组锋电位、放电频率、簇发放全部显著下降，神经网络活动受损。

5. 蛋白质组学分析

AD对比对照组：87个差异蛋白，76个上调、11个下调。上调蛋白包含已知AD标志物：GFAP、CD44、MAPT、IFITM3。通路富集：痴呆、AD通路、突触囊泡循环、神经变性通路。28个上调蛋白与人类AD脑组织公开数据集重叠，证明分子特征高度模拟病人。

四、药物验证实验 Lecanemab（仑卡奈单抗）

· 造模4周后，给药2周。
· 药效：6E10/4G8定量：Aβ负荷显著下降；3D重构显示小胶质吞噬Aβ能力增强，小胶质介导抗体的Aβ清除。
· 副作用模拟（APOE4/4类器官）：
VCAM‑1（血管内皮活化标志物）mRNA上调；
VE‑Cadherin（内皮紧密连接）有下调趋势； 提示血管炎症升高、血管完整性受损，模拟临床上 ARIA 相关血管损伤分子表型。

类器官模型创新点

• 多细胞全套组分：神经元+星形胶质+功能性小胶质+血管，绝大多数类器官缺少同时具备这四类细胞。
• 造模速度快：不需要家族 AD 基因突变；健康来源类器官，sAD脑提取暴露后4周即可复现Aβ、tau、炎症、突触丢失全套病理；传统 fAD 类器官需要3‑6个月。
• 适合抗体免疫药物筛选：含人源小胶质，可以评估抗体介导的蛋白清除，还可以评估药物血管相关副作用ARIA。

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