今天给大家介绍一种采用气液界面(Air-Liquid Interface, ALI)法培养的三维人全层皮肤(真皮+表皮)模型，包括原代细胞提取与培养、正常重组皮肤构建两大阶段。

主要用到的试剂盒

人ALI皮肤模型分化试剂盒组成(abs90781)

产品名称	规格	数量	储存温度及有效期
人原代成纤维细胞培养基	100mL	1	-20℃1年；2-8℃ 1个月
人原代角质细胞培养基	100mL	1	-20℃1年；2-8℃ 1个月
ALI成纤维培养基	60mL	1	-20℃1年；2-8℃ 1个月
ALI角质分化培养基A	25mL	1	-20℃1年；2-8℃ 1个月
ALI角质分化培养基B	25mL	1	-20℃1年；2-8℃ 1个月
ALI角质分化培养基C	25mL	1	-20℃1年；2-8℃ 1个月
ALI角质分化培养基D	35mL	1	-20℃1年；2-8℃ 1个月

注：如果不立即使用，请将以上组分按需分装并储存在-20℃下。请不要反复冻融。

1 原代细胞提取与培养

原代角质细胞与原代成纤维细胞提取与培养操作流程示意图

1.1 皮肤组织处理

a)实验材料准备：

• PBS(abs9459)；
• Hanks平衡盐溶液(含Ca²⁺、Mg²⁺，含酚红)(abs9436)；
• 分散酶Ⅱ(5mg/mL)(abs47038999，用Hanks(abs9436)溶解Dispase II冻干粉，配制成5mg/ml，用0.22µM滤膜过滤除菌)；
• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))；
• 胰蛋白酶/EDTA溶液(0.025%)(abs47014938，0.25%，需要用PBS稀释10倍)；

b)在10 mm小皿中倒入5 mL左右PBS，然后将样本从样本管倒入小皿中，用PBS反复吹洗样本2-3次，用力吹洗样本的正反面。

c)样本在75%酒精中涮洗1 s，然后迅速把样本转移至PBS中。

d)通过使用镊子搅拌10 mm 培养皿中的PBS来洗涤组织。

e)使用无菌镊子，将组织铺展平放于10 mm培养皿的翻转盖上，表皮侧朝下。

f)使用镊子剪掉所有脂肪和松弛的筋膜。为防止组织变干，请每隔几分钟用放入10 mm培养皿内的PBS冲洗一次。

g)修剪完成后，使用无菌手术刀将组织切割成0.5 cm³大小的组织块。

h)向15 mL无菌锥形离心管中加入5mL–8mL分散酶溶液。

i)将切割的组织转移到含有5mL—8mL分散酶溶液的试管中。确保组织块浸没在溶液中。盖紧试管。将试管转移到4 ℃冷藏冰箱中。在4 ℃下孵育16 h – 18 h小时。

j)分散酶酶解后，取回含有组织的试管，取出一个10 mm无菌培养皿，将酶解的组织和附带的分散酶溶液转移到10 mm培养皿底部，避免飞溅。如有任何组织块留在瓶中，请使用1 mL无菌移液器或无菌镊子将组织块转移到10 mm培养皿底部。将表皮与真皮分开。

k)一次处理一块组织，将组织块转移到培养皿的翻转盖上。调整组织块的方向，使表皮朝上。用一把无菌镊子固定组织块的一端，用另一把无菌镊子夹住表皮边缘。撕开/剥离真皮与表皮，使其分开位于同一盖子上。快速操作，为每个组织块重复该过程。

1.2 原代角质形成细胞提取与培养

(1)原代角质细胞提取

a)实验材料准备：

• 人原代角质细胞培养基(abs90781里组分)；
• 胰蛋白酶⁄EDTA溶液(0.025%)(abs47014938，0.25%，需要用PBS稀释10倍)；
• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))；
• PBS(abs9459)；
• Ⅰ型胶原(50μg/mL)(abs47014921，5 mg/mL，需要用6mM HAc 溶液稀释成50μg/mL；6mM HAc 溶液配制方法：取34.5μL 冰醋酸(17.4 M)加入100ml 双蒸水，充分混匀后用0.22μm 滤膜过滤除菌后待用)；
• 预包被Ⅰ型胶原的T25培养瓶(abs7011，向瓶中加入2 mL稀释后的Ⅰ型胶原(50μg/mL)，室温静置1 h，小心吸掉多余液体，用无菌PBS 清洗3~4 次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3 个月。)。

b)将表皮收集转入装有10 mL PBS的15 mL离心管中，1500 rpm，室温离心5 min；弃上清。

c)在60 mm小皿中倒入1 mL左右PBS，然后将样本从样本管倒入小皿中。

d)用手术刀将样本切为糊状，收集转入15 mL离心管，1500rpm，室温离心5min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，再加入5 mLPBS，反复吹洗，再次离心，1500rpm，室温离心5min。

e)弃上清，将5 mL - 8 mL 0.025%的胰蛋白酶⁄EDTA溶液添加到15 mL锥形管中，摇床220rmp，振荡15 min – 25 min。

f)向细胞悬液中加入5 mL – 8 mL完全培养基来中和胰蛋白酶⁄EDTA溶液，反复吹打以释放表皮细胞。

g)100 μm滤网过筛，用枪头研磨组织，使组织尽量完全过了筛网。1500 rpm，室温离心5 min，弃上清，不要移动细胞沉淀。

h)吸取1mL 原代角质形成培养基重悬细胞沉淀，反复吹打以确保细胞悬液均匀。取20 uL细胞悬液与20 uL的台盼蓝1:1混匀计数。

i)准备预先铺好Ⅰ型胶原的T25板，加入2 mL PBS清洗，弃掉PBS。

j)在一个瓶中加入细胞量为1.0×10⁶ - 2.5×10⁶的细胞悬液，添加培养基补至总体积为3 mL，放入培养箱培养。

k)原代角质形成细胞初始接种完成，观察到发生贴壁生长后，更换培养基，此后至少每48 h更换一次。

l)一旦细胞汇合80%，进行细胞进行传代培养或冻存。

(2)原代角质细胞传代

a)从培养瓶中移除所有培养基。向培养瓶中加入2 mL不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被。

b)立即从培养瓶中移除PBS溶液，并加入2 mL 0.025%的胰蛋白酶⁄EDTA溶液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀，室温下孵育5 min – 10 min。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离。

c)从培养瓶中释放细胞后，将2 mL 完全培养基添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞。

d)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入1 mL角质形成细胞培养基重悬，使用计数仪测定悬液中的细胞浓度。

e)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入3 mL角质形成细胞培养基重悬；

f)将细胞稀释于补充培养基中，并以细胞总量为5×10⁵ - 1×10⁶的密度接种于预包被并清洗后的T25培养瓶中，加入培养基补齐至3 mL，于培养箱中培养。此后至少每48 h更换一次。

(3)原代角质形成细胞冻存

a)消化步骤同原代角质细胞传代操作步骤。

b)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入1mL冻存液(FBS+10%DMSO)，重悬，转至2 mL冻存管中。冻存管放入程序降温盒中，放置于-80℃冰箱，次日转入液氮。

1.3 原代成纤维细胞提取与培养

(1)原代成纤维提取

a)实验材料准备：

• 人原代成纤维细胞培养基(abs90781里组分)；
• 重组胰酶细胞消化液(abs9411)；
• 胶原酶Ⅳ溶液(10 mg/mL)(abs47048003，用Hanks(abs9436)溶解DMEM(abs9483)溶解胶原酶Ⅳ冻干粉，配制成10mg/ml，用0.22µM滤膜过滤除菌)；
• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))；
• PBS(abs9459)；
• Ⅰ型胶原(50μg/mL)(abs47014921，5 mg/mL，需要用6mM HAc 溶液稀释成50μg/mL；6mM HAc 溶液配制方法：取34.5μL 冰醋酸(17.4 M)加入100ml 双蒸水，充分混匀后用0.22μm 滤膜过滤除菌后待用)；
• 预包被Ⅰ型胶原的T25培养瓶(abs7011，向瓶中加入2 mL稀释后的Ⅰ型胶原(50μg/mL)，室温静置1 h，小心吸掉多余液体，用无菌PBS 清洗3~4 次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3 个月。)。

b)将真皮收集转入装有10 mL PBS的15 mL离心管中，1500rpm，室温离心5 min；弃上清。

c)在60 mm小皿中倒入1 mL左右PBS，然后将样本从样本管倒入小皿中。

d)用眼科剪将样本切为糊状，收集转入15 mL离心管，1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，再加入5mL组织清洗液，反复吹洗，再次离心，1500 rpm，室温离心5 min。

e)弃上清，将5 mL - 8 mL 10 mg/mL 胶原酶Ⅳ溶液添加到15 mL锥形管中，摇床220 rmp，振荡70 min - 80 min。

f)向细胞悬液中加入5 mL – 8 mL 完全培养基来终止胶原酶Ⅳ溶液，反复吹打以释放成纤维细胞。

g)100 μm滤网过筛，用枪头研磨组织，使组织尽量完全过了筛网。1500 rpm，室温离心5 min，弃上清，不要移动细胞沉淀。

h)添加3 mL红细胞裂解液，4 ℃放置3 min，1500 rpm离心5 min，弃上清；若红细胞未裂解完全则重复裂解操作一次。

i)吸取1 mL 原代成纤维培养基重悬细胞沉淀，反复吹打以确保细胞悬液均匀。取20 uL细胞悬液与20 uL的台盼蓝1:1混匀计数。

j)准备预先铺好Ⅰ型胶原的T25板，加入2 mLPBS清洗，弃掉PBS。

k)在一个瓶中加入细胞量为5×10⁵ - 2×10⁶的细胞悬液，添加培养基补至总体积为3 mL，放入培养箱培养。

l)原代成纤维细胞初始接种完成，观察到发生贴壁生长后，更换培养基，此后至少每48 h更换一次。

m)一旦细胞汇合80%，进行细胞进行传代培养或冻存。

(2)原代成纤维细胞传代

a)从培养瓶中移除所有培养基。向培养瓶中加入2 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被。

b)立即从培养瓶中移除PBS溶液，并加入2 mL 类器官解离试剂溶液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀，室温下孵育3 min – 5 min。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离。

c)从培养瓶中释放细胞后，将2 mL完全培养基溶液添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞。

d)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入1 mL成纤维细胞培养基重悬，使用计数仪测定悬液中的细胞浓度。

e)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入3 mL成纤维细胞培养基重悬；

f)将细胞稀释于补充培养基中，并以细胞总量为5×10⁵ - 1×10⁶的密度接种于预包被并清洗后的T25培养瓶中，加入培养基补齐至3 mL，于培养箱中培养。此后至少每48 h更换一次。

(3)原代成纤维细胞冻存

a)消化步骤同原代成纤维细胞传代操作步骤；

b)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入1 mL冻存液(FBS+10%DMSO)，重悬，转至2 mL冻存管中。冻存管放入程序降温盒中，放置于-80 ℃冰箱，次日转入液氮。

2 正常重组皮肤构建

皮肤模型构建操作流程示意图

2.1 实验前准备：

1、在原代细胞培养阶段，试验使用前提前从冰箱取出所需体积的人原代成纤维细胞培养基和人原代角质细胞培养基，于冰上融化。
2、在成纤维培养阶段，试验使用前提前从冰箱取出所需体积的ALI成纤维培养基，于冰上融化。
3、在角质分化阶段，试验使用前提前从冰箱取出所需体积的ALI角质分化培养基，于冰上融化。
4、根据实验需求，调整I型胶原蛋白的浓度，冰上预冷备用。

2.2 真皮层构建(以Transwell小室24孔板为例)：

1、实验材料准备：

• ALI成纤维培养基；
• 重组胰酶细胞消化液(abs9411)；
• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))；
• PBS(abs9459)；
• PBS(10X)(abs961)；
• NaOH(0.1M)；
• Ⅰ型胶原(4.38 mg/mL)(abs47014921，5mg/mL，需要用6mM HAc 溶液稀释成4.38 mg/mL；6mM HAc 溶液配制方法：取34.5μL 冰醋酸(17.4 M)加入100ml 双蒸水，充分混匀后用0.22μm 滤膜过滤除菌后待用)；
• 细胞小室(PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板)(abs7280)

2、从培养瓶中移除所有培养基。向培养瓶中加入2 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被；

3、立即从培养瓶中移除PBS溶液，并加入2 mL 重组胰酶细胞消化液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀，室温下孵育3 min – 5 min。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离；

4、从培养瓶中释放细胞后，将2 mL DMEM完全培养基溶液添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞；

5、将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，备用；

6、在冰上将Ⅰ型胶原用1M NaOH调节PH为中性，比例约为Ⅰ型胶原：PBS：0.1M NaOH=1 mL：120 μL：200 μL，充分混匀；

7、向细胞沉淀中加入调节为中性的Ⅰ型胶原，并以5×10⁶cells/mL的密度将细胞以每孔120 μL接种于24孔Transwell小室中，均匀铺满小室底面，转移至培养箱中37 ℃放置一个小时，待胶原凝固；

8、胶原凝固后，在小室内加入100μL ALI成纤维培养基，小室外加入200 μL ALI成纤维培养基，转移至培养箱培养；

9、每天更换小室内外的ALI成纤维培养基，培养4天后可在镜下观察到成纤维细胞生长，将其作为真皮层，此时可在真皮层上接种角质形成细胞。

2.3 表皮层构建( 以24孔板为例 )：

1、实验材料准备：

• 表皮分化A-D阶段培养基；
• PBS(abs9459)；
• 胰蛋白酶/EDTA溶液(0.025%)(abs47014938，0.25%，需要用PBS稀释10倍)；
• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))

2、从培养瓶中移除所有培养基。向培养瓶中加入2 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被；

3、立即从培养瓶中移除PBS溶液，并加入2 mL 10%的胰蛋白酶/EDTA溶液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀，室温下孵育5 min–10 min。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离；

4、从培养瓶中释放细胞后，将2 mL完全培养基添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞；

5、将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，备用；

6、以每孔5×10⁵的细胞量用100 μL 分化培养基A重悬接种入24孔Transwell小室中，待其形成表皮层；

7、分化阶段A：向小室外加入200 μL分化培养基A并每天换液，分化2天后，弃去小室内外的分化培养基A，完成分化阶段A的分化；

8、分化阶段B：向小室外加入200 μL分化培养基B并每天换液，培养2天后，弃去小室外的分化培养基B，完成分化阶段B的分化；

9、分化阶段C：向小室外加入200 μL分化培养基C并每天换液，培养2天后，弃去小室外的分化培养基C，完成分化阶段C的分化；

10、分化阶段D：向小室外加入200 μL分化培养基D并每天换液，培养3天后，完成表皮分化；取出小室，用手术刀取下其中一个小室中的PET膜及其黏附的全层皮肤组织，将组织浸入组织固定液中，送检测定HE。

备注：只有阶段A小室内外含培养基，阶段B、C、D小室内都不含培养基，只有小室外含培养基。

2.4 注意事项

1. 本产品在使用前需平衡至室温。
2. 使用产品时应注意无菌操作，避免污染。
3. 本品含抗生素，如无特殊需要，可直接使用，无需任何添加。
4. 为保持本产品的最佳使用效果，不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中。
5. 为达到预期效果，请于保质期内使用本产品。
6. 离心弃上清时，底部不要完全弃尽，防止损失样本量。
7. 本模型构建涉及多步消化过程，消化时间过长会影响细胞活性。
8. Ⅰ型胶原偏酸性，室温下不易凝固，需要调节PH为中性才易凝固。
9. Ⅰ型胶原浓度偏低，不易凝固，本实验采用4.38mg/mLⅠ型胶原，经多次试验测试能够凝固，若购买Ⅰ型胶原浓度过低，可用高浓度Ⅰ型胶原进行调节，凝固完全才能加入培养基
10. 在构建表皮时需在镜下确定真皮层的成纤维细胞状态良好。原代成纤维细胞由组织消化接种为P0代，进行重构皮肤构建时，需使用P5代以前的角质形成细胞。成纤维状态跟成纤维代次相关，代次越高，状态越差；且消化时间长短严重影响成纤维状态，消化过度，成纤维在Ⅰ型胶原内几乎不生长。
11. 原代角质细胞由组织消化接种为P0代，进行重构皮肤构建时，需使用P3代以前的角质形成细胞。
12. 在完成模型构建后，用手术刀小心取下模型，避免损伤质地柔软的模型组织。
13. 本产品仅用于科研用途，不能用于体外诊断。

2.5 模型鉴定

ALI培养人3D皮肤模型

• 使用爱必信的人ALI皮肤模型分化试剂盒可成功在Transwell小室中培养分化出全层皮肤(真皮+表皮)。
• 其中表皮可分化出清晰的四层结构(基底层、棘层、颗粒层、角质层)，与原始组织一致。
• 不同浓度SDS作用24h后，检测细胞活力，半数抑制浓度IC50≥1.0 mg/mL。表明自研构建的重组人类表皮模型具备完整的屏障功能，至少能有效抵抗0.1% SDS持续24小时的刺激。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎入群交流哦！

产品推荐

货号	品名	规格
abs90781	人ALI皮肤模型分化试剂盒	1kit
abs9459	PBS	500mL
abs961	PBS(10X)	500mL
abs9436	Hanks平衡盐溶液(含Ca2+、Mg2+，含酚红)	500mL
abs47038999	分散酶Ⅱ	100mg
abs9483	DMEM	500mL
abs972	FBS	500mL
abs47014938	胰蛋白酶/EDTA溶液(0.25%)	100mL/500mL
abs47014921	胶原蛋白I型(鼠尾)	2mL/10mL
abs9411	重组胰酶细胞消化液	100mL
abs47048003	胶原酶Ⅳ	100mg
abs7011	T25培养瓶	1箱
abs7280	细胞小室(PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板)	1箱

关键词：皮肤模型、ALI皮肤模型、气液界面皮肤模型、人全层皮肤模型、真皮+表皮模型