PHA-E与PHA-L结合特性差异

PHA-L（白细胞凝集素）

由4个L亚基经色谱纯化获得的四聚体，具有：

• 高促有丝分裂活性
• 白细胞凝集活性高
• 红细胞凝集活性极低
• 广泛用于人和小鼠淋巴细胞的体外活化研究
• 常用作PBMC的刺激物、INF-γ ICS和ELISPOT实验的阳性对照

PHA-E（红细胞凝集素）

纯化的E4异构体，具有：

• 高红细胞凝集活性（8 μg/mL可促进人红细胞凝集）
• 低促有丝分裂活性
• 主要用于糖基化修饰研究和红细胞凝集实验
• 不具有血型特异性，但凝集作用可被某些寡糖抑制

PHA-M（粘性蛋白形式）

PHA的粘性蛋白形式（mucoprotein form），含有5种异构体（与PHA-P成分相似）：

• 强大的红细胞凝集特性
• 最初用于从全血中分离淋巴细胞
• 含有L和E两种亚基分子的混合物

PHA-P（原PHA蛋白形式）

未分离纯化PHA-E和PHA-L之前的原始形式，包含PHA-E及PHA-L两种分子：

• 粗提物形式
• 含有两种亚基的混合活性
• 常用于红细胞凝集滴定实验

T淋巴细胞活化信号通路

外周血单个核细胞（PBMC）刺激

PHA是体外诱导人PBMC增殖的标准刺激剂，常用于：

• 淋巴细胞转化试验（Lymphocyte Transformation Test）
• 细胞免疫功能评估
• 免疫缺陷病诊断辅助

细胞因子检测的阳性对照

• 胞内细胞因子染色（ICS）：用作INF-γ、IL-2、TNF-α等细胞因子检测的阳性对照
• ELISPOT实验：验证细胞分泌功能，检测抗原特异性T细胞应答

流式细胞术分析

• 淋巴细胞亚群功能检测
• 增殖标志物（如Ki-67、CFSE稀释）检测的阳性刺激对照

淋巴细胞分离

利用PHA-M或PHA-E的红细胞凝集特性，从全血中分离淋巴细胞（早期应用）。

储存液制备

• 粉末形式：用无菌PBS（pH 7.2或6.8）或无水水溶解，配制1-10 mg/mL储存液
• 液体形式：按产品浓度分装，-20°C保存，避免反复冻融
• 储存稳定性：-20°C分装冻存可稳定数月

工作液配制

• 用无菌PBS或细胞培养液直接稀释至工作浓度
• 建议工作浓度：5-10 μg/mL（刺激外周血淋巴细胞）
• 实际浓度需根据实验体系和细胞类型优化摸索

红细胞凝集实验设置（以96孔板为例）

浓度优化

PHA的促分裂活性存在明显的剂量依赖性：

• 浓度过低（<1 μg/mL）：刺激不充分，增殖反应弱
• 浓度过高（>20 μg/mL）：可能导致细胞过度活化、凋亡或细胞毒性
• 建议设置浓度梯度（1、5、10、20 μg/mL）进行预实验优化

细胞质量控制

• 小鼠脾细胞或人外周血单个核细胞经刺激活化后，应通过细胞增殖检测（如³H-TdR掺入、CFSE稀释、Ki-67染色）验证本品活性
• 细胞活力应>90%，死细胞过多会影响刺激效果

无菌操作

• 所有操作需在无菌条件下进行
• 储存液和工作液应无菌过滤（0.2 μm滤膜）
• 避免微生物污染导致细胞死亡

安全性

操作时应穿实验服并佩戴一次性手套，避免直接接触皮肤。