1. 蓝色产物生成：HRP催化TMB失去电子，形成阳离子自由基（Cation Radical），随后进一步氧化生成电荷转移复合物（Charge-transfer complex），呈现可溶性的蓝色，最大吸收波长为370nm（部分文献报道650nm处也有吸收峰）

2. 酸终止与黄色产物：当加入酸性终止液（如0.5-2M H₂SO₄、0.5M HCl或1M H₃PO₄）后，蓝色产物质子化转变为二亚胺（Di-imine，双阳离子），颜色由蓝色变为黄色，最大吸收波长移至450nm

操作简化

无需配制，直接滴加使用，避免人为操作误差

稳定性高

预混配方通过特殊稳定剂保持各组分相容性，2-8°C避光保存条件下具有较长的保质期

结果可靠

消除因配制不当导致的沉淀问题，孔间差异（CV值）显著降低

效率提升

特别适合高通量筛选（HTS）和自动化工作站，每100mL可检测约1000个ELISA样品

标准型/普通型

适用于常规ELISA定量分析，具有较宽的线性范围和低本底特点。室温显色时间通常为10-30分钟，或37°C显色10-30分钟，适用于大多数常规检测。

超敏型（Super Sensitive）

专为检测低丰度抗原或弱抗体反应设计。在系列TMB底物中具有最高的显色效率，可在2-10分钟内产生明显的蓝色信号。推荐用于：

• 定性检测（如抗体筛选、阳性克隆鉴定）
• 低表达蛋白的ELISA检测
• 需要缩短显色时间的快速检测流程

宽量程型（Broad Range）

优化了动态检测范围，可同时检测高浓度和低浓度样品而不易饱和，特别适合：

• 定量ELISA分析
• 需要建立标准曲线的精确定量实验
• 样品浓度差异较大的批量检测

膜印迹专用型（Membrane Blotting）

专门针对Western Blot、斑点杂交、Southern Blot、Northern Blot等膜免疫实验设计。与普通可溶型TMB不同，膜专用型在反应位点产生紫色不可溶沉淀物，背景极低甚至无背景，且可直接用水终止反应（无需强酸），避免了强酸对硝酸纤维素膜或PVDF膜的损伤。

准备工作：

• 将单组分TMB显色液从2-8°C冰箱取出，平衡至室温（如含甘油成分，需在37°C水浴复温至液体状态）
• 确保显色液澄清无色，若出现浑浊或变蓝表明已氧化失效，应停止使用

1. 充分洗涤

HRP标记抗体孵育完成后，用PBST（含Tween-20的PBS）或TBST洗涤3-5次，每次3-5分钟，彻底去除未结合的酶标抗体（这是降低背景的关键）

2. 加样显色

去除洗涤液，每孔加入100μL单组分TMB显色液

3. 避光孵育

室温（20-37°C）避光孵育5-30分钟，或根据实验需求延长至24小时，直至显色达到预期深浅（蓝色）

注意：显色时间需根据抗原抗体亲和力优化，过度显色（>30分钟）可能导致本底升高

4. 读数或终止

• 直接读数：在370nm波长下测定吸光度（适用于动力学分析）
• 终止读数：加入100μL 0.5-2M H₂SO₄终止反应，颜色由蓝变黄，在450nm测定吸光度（建议在终止后30分钟内完成读数，避免黄色产物降解）

酶联免疫吸附试验（ELISA）：

• 抗原/半抗原定量检测（如细胞因子、激素、病原体蛋白）
• 抗体滴度测定（如疫苗免疫效果评估）
• 药物筛选和抗体药物制备中的阳性克隆鉴定

膜印迹免疫检测：

• Western Blot：蛋白质表达的定性检测，TMB显色产生的条带可长期保存（拍照记录），无需暗室和胶片
• 斑点杂交（Dot Blot）：快速筛选阳性克隆或检测核酸/蛋白质样品
• Southern/Northern Blot：核酸杂交后的HRP显色检测

组织化学：

免疫组化（IHC）中的HRP显色，用于组织切片中特定蛋白的定位观察

安全防护：

• 单组分TMB显色液含TMB和H₂O₂，对皮肤和黏膜有刺激性
• 操作时必须穿实验服、佩戴一次性手套和防护眼镜
• 如不慎接触皮肤，应立即用大量清水冲洗

显色控制：

• 背景过高：检查封闭是否充分（建议使用5%脱脂奶粉或BSA）、洗涤是否彻底、二抗浓度是否过高
• 无显色或显色弱：检查HRP标记抗体是否失活、显色液是否失效（变蓝或浑浊）、显色时间是否不足
• 显色不均：确保显色液均匀覆盖孔底，避免气泡产生

特殊提示：

• 避光保存：TMB对光敏感，未使用完的显色液应立即放回2-8°C避光保存，避免氧化
• 终止时机：对于超敏型TMB，需密切观察显色进程，一旦达到理想颜色深度立即终止，防止信号过饱和
• 膜印迹专用型：用水终止后应立即拍照记录，不可长期放置，避免沉淀扩散