RNA转染注意事项

时间：2022-08-03 点击次数：457

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RNA转染技术是将RNA分子如mRNA、siRNA、病毒RNA等导入细胞并进行表达的过程。RNA转染技术主要用于研究RNA的功能，其中miRNA的转染已经成功应用于抑制目的基因的表达及其功能研究中。

不同的实验技术都是为了满足不同的实验需要，RNA转染提供了另一种有别于DNA转染的研究探索手段——直接将体外翻译的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖体利用转染技术带入细胞中。由于不需要经过转录即可直接翻译，RNA转染得到的结果比DNA转染更快更直接，当然仅限于瞬时表达。RNA转染的这些特性很适合某些研究：比如处于非分裂期的细胞转染或者很难用质粒转染的细胞，RNA病毒的研究，反义RNA的转染，siRNA转染(RNA干扰)等等。

RNA转染注意事项

1. 转染试剂
转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用，即使试剂本身兼容DNA和RNA污染，因RNA和DNA大小不同，转染条件不同，所需的试剂也应不同，所以RNA专用的转染试剂会更好一些。
ps.还有重要的一点就是要采用优质无RNAse污染的血清。
2. RNA转染时RNA的用量
RNA转染的用量必须参考RNA转染试剂说明，因为RNA和转染试剂的比例决定了转染复合物的结构和净电荷，以及是否容易被细胞膜吸附和内吞。RNA少了固然表达不好，太多也会有毒性的问题。
3. RNA本身的结构
除了操作，RNA本身的结构对转染有一定的影响，哺乳动物的额mRNA分子带有5’端帽子结构和3’端Poly A尾巴，此外还有成为IRES（internal ribosomal entry site）的核糖体结合区，这些结构或者有助于提高mRNA的稳定性，或者有助于核糖体结合到mRNA上进行翻译。
RNA转染过程中的影响因素比较多，如RNA的机构、RNA转染时RNA的用量、RNase的污染、进入细胞后RNA的降解等因素使RNA的转染过程更加复杂、给转染结果带来影响，其中RNA在转入细胞后的降解问题在RNA转染过程中是比较重要的，如果转染的RNA在进入细胞体后大量降解，那么实验结果就很不准确了。
mRNA转染的优点
· 无需核吸收——蛋白直接在细胞质中表达
· 其蛋白质表达比DNA转染更快
· 以完全不依赖启动子的方式表达蛋白质
· 没有基因组整合的风险
· 非常适合转染生长缓慢或不分裂的细胞
· 蛋白表达与mRNA的量直接相关
· 瞬时转染：蛋白质的表达在有限的时间内持续，避免了与积累有关的毒性

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备注：所有工具RNA均使用 Cap AG结构共转录加帽，修饰碱基5种可任选其一（5-Methoxy-UTP，5-Methyl-CTP，N1-Methylpseudo-UTP，N6-Methyl-ATP，Pseudo-UTP。）

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核苷酸修饰

作用

 Pseudo-UTP (Ψ) 假尿苷

改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。降低mRNA的免疫原性，提高mRNA的稳定性并增强其翻译能力

N1-Methylpseudo-UTP (mΨ) 甲基假尿苷

通过增加核糖体密度以 eIF2α 依赖性和独立机制增强翻译，比假尿苷修饰更能降低mRNA的免疫原性，并可增强mRNA的蛋白表达能力

N6-Methyl-ATP（m6A）

与mRNA 的稳定性、剪接加工以及microRNA 的加工有关，可促进mRNA的翻译

5-Methyl-CTP (5mC)

m5C 修饰连同多种效应酶，执行多种功能；m5C的分布因细胞类型而异，在mRNA的特定位置上的m5C修饰表现出不同的调控活性：它们可以促进或抑制翻译

5-Methoxy-UTP(5moU)

可以降低所得mRNA 的免疫原性，促进蛋白表达，对炎性巨噬细胞反应的诱导可忽略不计

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