上两次的分享主要汇总了ELISA实验样本准备和操作步骤中的常见问题和解决方法，细节注意才能得到好的ELISA实验结果。ELISA实验，拿到结果还不是结束，最后还需要进行数据处理，我们ELISA常见问题的解答第三篇，也是最后一篇，就主要给大家解答一下ELISA数据处理中常见的问题，帮助大家避开“雷区”，大家快看看这其中有没有困扰你ELISA实验的问题吧~

Q：ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？

A：根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。

Q：因为检测限的原因，同一块ELISA板子，样本稀释比例不同，部分样本1:10稀释，部分1:20稀释，这样设置可行吗？结果可以比较吗？

A：可以比较，不同稀释比例，是因为不同样本间的表达差异较大，只要保证稀释后的检测样品测量值准确，还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。

Q：测得的值都低于标准曲线的最低值，是什么原因，应该怎么解决？

A：这种情况需要设置实验对照组来排查，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，检查其他待测样品是否稀释倍数过高，可以降低稀释比，直至直接加样本原液，如还检测不出，则表明该指标在其余待测样品表达含量低于检测下限，按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见，在健康样本中，表达含量极低。

Q：标准曲线在推荐的浓度下，r²值为0.9，做了多次都是这样，怎么办？

A：这种情况首先要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，如爱必信的ELISA试剂盒，需要使用四参数拟合方式进行拟合，用错拟合方式，会导致r2值较低；如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验过程中是否出现污染或标准品倍比稀释时出现失误，导致加样不准。

Q：试剂盒推荐用450和570nm双波长检测，但条件有限可否换成450和620的双波长？如何使用校准波长？还有，用空白孔校准可以么？

A：可以的，TMB底物显色后，吸光峰值在450nm，另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置，避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值，用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法，因为避免了不同孔的读数影响，防止出现空白孔污染，导致读数较高，无法校准的情况。

Q：样本总是在标准曲线之外，稀释100倍也是，怎么办？

A：在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达极高的蛋白，确实会出现这种情况，之前小编接到过的案例，样品需要稀释10000倍，目的蛋白才落在检测区间内。建议继续提高稀释比例。

Q：最后显示的OD值在多少之间属于可用值，有要求吗？

A：有的，建议标准曲线最高浓度点的OD值在2.0左右较好，也可参考说明书标曲的数据。

好啦，我们汇总的关于ELISA实验的常见问题至此已经全部分享给大家，看完这些之后各位小伙伴对自己的ELISA实验是不是更有信心了呢？如果大家在实验中遇到什么新的问题也可以咨询我们，小编随时为您解答~

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