实验原理：

多重荧光免疫组化（mIHC），主要的技术原理来自TSA技术，TSA即酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H₂O₂下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大。

简单来说，用这种方法做多重荧光染色是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。该荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后进行微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。

 

操作步骤：

1、样本处理：取出样本，放入对应包埋盒并编号。

2、脱水、透明、浸蜡处理：75%乙醇（1h）——85%乙醇（1h）——95%乙醇（1h）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——63℃石蜡（50min）——63℃石蜡（50min）——63℃石蜡（50min）。

3、包埋处理：脱水结束后放入预热的包埋机，按要求确定包埋方向进行包埋。

4、切片制备：切片厚度4μm，切片在46℃自来水中弹片，待切片上组织充分展开后捞片。

5、染色

    （1）烤片：60℃烤片 30min。（烤片时间视组织类型而定，一般组织30min即可，骨组织等要延长时间至1h)

    （2）脱水、水化：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去离子水（5min)。

    （3）抗原修复。取200ml抗原修复液（根据一抗说明书要求选择用柠檬酸钠或者EDTA），加入染色盒中，将脱蜡水化后的组织切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，将抗原修复完的组织切片画上阻水圈，置入PBST浸洗3次，每次3min。（修复时间依据染色情况而定，针对阳性着色较浅的可适当延长抗原修复时间，反之，缩短抗原修复时间）

    （4）每切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节） 3% H2O2，室温下孵育10min，PBST 浸洗3min×3次。

    （5）除去PBS液，每张切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节）5%山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。

    （6）每张切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节）稀释后的一抗，室温保湿孵育1h（或过夜4℃孵育16小时），PBST浸洗3min×3次。

    （7）除去PBST，每张切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节）二抗，室温保湿孵育15min，PBST浸洗3次，每次3min。

（8）除去PBST，每张切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节）现配的1*TSA染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），孵育10min后，置入PBST内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min，。

（9）第一轮染色完成的切片，再次置入抗原修复液（根据下一个要染的一抗要求选择合适的修复液）中进行第二轮修复。之后重复（5）-（8）步骤。

（10）重复以上步骤，直至所有目标抗体染色完成。

（11）滴加1*DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*PBST浸洗玻片3次，每次2min。

（12）滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。（长期保存或需要运输，请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封）

（13）扫描成像，数据分析

Tips：本实验在孵育步骤请选用避光湿盒（黑色孵育盒）孵育，其余操作正常在光下进行即可，染完的片子保存在4℃时也需要避光，若没有避光切片盒，可以用锡纸将切片盒包裹，也有避光效果。