小爱课堂：免疫组化实验操作及注意事项（上）
时间：2019-09-08 点击次数：802
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免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的一项技术。IHC是一项基础研究实验，其总体实验难度较低，但想要做出漂亮的染色结果却没有那么简单，往往在某一个细节的疏忽会导致结果的差异较大，下面小爱为大家分析一下实验的注意事项，希望同学们在此方面多加注意。
1、标本固定
固定的目的是为了使蛋白质凝固，减少或终止内源性/外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保存组织或细胞内的抗原性。现在常用的固定剂有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。有些固定剂对特殊组织有更好的效果，如苦味PLP固定液对于含糖组织保存更好，Helly固定液对于胰岛和垂体效果较好等。
2、脱水、石蜡包埋和制片
脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水，对于一些易脆的组织应减少高浓度酒精里的停留时间，透明的时间也应该控制缩短。对组织浸蜡时，一般选用56℃-58℃熔点石蜡，浸蜡温度最好不超过60℃，防止抗原的损失。包埋时应果断迅速，切片时注意检查刀片是否出现缺口，防止；蜡带出现裂痕。
3、脱蜡和水化
使组织恢复到固定后的正常状态暴露抗原，方便与一抗结合。若脱蜡与水化不完全易出现局灶性反应和浸洗不完全，产生非特异性背景着色。
4、抗原修复
由于组织在甲醛或多聚甲醛在固定中，发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率，常用方法通常使用高压加热修复，使用高压加热修复对修复温度和时间的把握十分重要，温度越高修复时间越短，温度与修复时间呈负相关。修复结束后注意室温冷却，让蛋白自然复性。另外，大家尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆影响。
5、标本固定
传统的免疫组化法容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须对其进行灭活和封闭。灭活内源性过氧化酶一般用3%过氧化氢灭活10min左右，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织。
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