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免疫印迹(wb实验)常见问题解答之上样、电泳与转膜

时间：2019-08-22 点击次数：6705

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1）WB实验使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，两者如何选择？

PVDF膜价格相对NC较贵，但可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。具体使用还要参考相关实验需求。

2）半干转膜是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？　

可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

3）Western blot实验哪种染色好？

● 阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。

● 胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。

● 生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。

4）wb实验中，如果不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？

可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《爱必信实验指南之Western blot手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间

5）蛋白免疫印迹实验时，PVDF膜重复利用几次？

重复利用指的是可以在显影定影完成以后重新洗脱（stripping buffer）然后重新封闭，一抗（可以是不同的，前提是目的蛋白在pvdf膜上），二抗孵育，显影定影。重复利用的情况还要看实验你的蛋白丰度，每一次stripping都会洗掉蛋白，同时有些抗体结合紧的也洗不完全，所以要看根据具体实验情况而定。

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WB实验上样、电泳与转膜相关产品推荐：

实验步骤	推荐指数	货号	产品名称	规格
上样与电泳		abs9226	DTT溶液(1mol/L)	5ml,10ml
		abs9237	2X Laemmli样品缓冲液	5ml*2
		abs9238	10%SDS十二烷基硫酸钠溶液	500ml
	★★	abs953	2*上样缓冲液 (适用于SDS-PAGE)	10ml
	★★	abs9301	预制胶 10%,10 wells	5片/盒
	★★	abs9308	预制胶 10%,15 wells	5片/盒
	★★	abs9302	预制胶 12%,10 wells	5片/盒
	★★	abs9309	预制胶 12%,15 wells	5片/盒
		abs9303	预制胶 15% ,10 wells	5片/盒
		abs9310	预制胶 15% ,15 wells	5片/盒
		abs9304	预制胶 4-15%, 10 wells	5片/盒
		abs9311	预制胶 4-15%, 15 wells	5片/盒
	★★	abs9305	预制胶 4-20%, 10 wells	5片/盒
	★★	abs9312	预制胶 4-20%, 15 wells	5片/盒
		abs9307	预制胶 8%, 15 wells	5片/盒
		abs9306	预制胶 8-20%, 10 wells	5片/盒
		abs9313	预制胶 8-20%, 15 wells	5片/盒
	NEW	abs9328	3-5kd小分子量预制胶，16.5%，10wells	10片/盒
	NEW	abs9329	3-5kd小分子量预制胶，16.5%，15wells	10片/盒
	★★★	abs925	蛋白电泳套装	盒
		abs951	running buffer	100ml,1L
	★★★★★	abs923	预染蛋白marker, 10-245 KDa	500ul,5*500ul
	★★★★★	abs924	预染蛋白marker, 10-180 kDa	250ul,2*250ul
		abs966	Genshare考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液	500ml
	★★★	abs964	考马斯亮蓝染色试剂盒(常规型)R250	1kit
		abs965	考马斯亮蓝染色试剂盒(增强型)G250	1kit
转膜		abs931	PVDF膜0.2 μm	20张
	★★	abs932	PVDF膜0.45 μm	20张
	★★	abs959	NC膜0.2 μm	20张
		abs960	NC膜0.45 μm	20张
		abs950	10*电转液	100ml,1L

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WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

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