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ELISA trouble shooting

时间:2016-06-17 点击次数:1837

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问题一:阴性对照出现阳性结果
可能的原因 解决的方法
试剂/样品污染 试剂和样品可能被污染,或者由于孔之间的溅洒交叉污染。使用新鲜试剂,小心操作移液器
夹心ELISA-检测抗体与包被抗体反应 确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体,他们之间不会相互反应
酶标板洗板不彻底 用洗液充满板空确保每孔被充分洗涤,洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净
抗体量过多导致非特异性结合 根据推荐用量使用抗体尽量使用较少的抗体

 

问题二:酶标板整体背景高
可能的原因 解决的方法
结合反应太强或时间过长 检查底物的稀释,使用建议的稀释度。当酶标仪显色足够进行吸光度读取是立即用终止液终止反应
底物溶液或终止液不是新鲜配制的 使用新鲜配制的底物溶液。终止液应该是清亮的(如果它变黄,这是被污染的标志,需要重新配制)
没有终止反应 如果底物反应没有被终止,颜色会继续变化
酶标板在酶标仪度板前放置时间过长 颜色会继续变化(尽管加了终止液,依然会以很慢的速度变化)
实验器皿污染 确保试剂是新鲜配制的并且使用的是清洁的玻璃器皿
底物孵育过程没有曝光 底物孵育应该在避光条件下进行
孵育温度过高 抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性。确保孵育在正确的温度下进行,孵育箱要设定好温度并正常工作,孵育温度可能需要一些优化
抗体非特异性结合 确保进行了封闭并使用的是恰当的封闭液。我们建议使用5-10%的与二抗同种动物来源的血清或牛血清。确保孔板进过预处理以防止非特异性结合。使用亲和力强、纯度高的抗体,最好经过了预吸收

 

问题三:吸光度数值低
可能的原因 解决的方法
使用的样品中没有显示靶蛋白或者靶蛋白显示的水平低 检查靶蛋白表达系统,确保它在您的样品中被表达出来。如果靶蛋白的表达水平低,需要增加样品使用量,或者您可能需要选择一个更加灵敏的检测方法。确保您使用的是没有超过测定方法检测范围的阳性对照
抗体不足 确定使用的是建议的抗体量,为了使结果更好可能需要增加抗体的浓度
底物溶液不是新鲜配制或成分有误 使用新鲜配制底物溶液。确保储备液在有效期内并且正确保存,使用的浓度也是正确的,确保试剂按正确的浓度使用
试剂不是新鲜配制或pH值有误 确保试剂配制正确并在有效期内
孵育时间不够长 如果建议了孵育时间,确保按推荐的时间长度孵育抗体。为了使结果更理想,孵育时间可能需要增加
孵育温度太低 抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性,确保孵育时在正确的温度下进行,孵育箱要设定好适宜的温度并正常工作。孵育温度可能需要一些优化。确保所有的试剂在使用前是室温
未加终止液 加入终止液可以增加显色反应的强度,也能固定反应最终的颜色

 

问题四:吸光值高
可能的原因 解决的方法
样品和/或阳性对照吸光度数高。吸光度没有按样品在板上的稀释梯度递减 样品或阳性对照的浓度过高,超出了实验方法检测的范围。重新设置实验方法或者在加样前稀释降低样品和对照的浓度,在处理结果计算浓度时考虑到所作的稀释

 

问题五:酶标板上吸光度不规律
可能的原因 解决的方法
孵育时酶标板叠在一起 酶标板叠在一起使板子每个孔的温度不能平衡一致,请避免堆积
吸液不一致 确保移液器使用正确并进过校准、确保枪头差的足够紧密。板子稀释时要特别仔细,注意确保每个枪头都吸上和排除正确量的液体,这对平行样品结果的一致性有很大影响
抗体稀释液/试剂 为保证板子所有孔的浓度一致,确保所有的试剂和样品在加到板子上以前都被均匀混合
孔板变干涸 确保所有孵育期间酶标板始终被盖好。放置一个潮湿的水盘(确保清洁,无菌水)在孵育箱底部
洗板不充分 这将导致一些孔没有其他孔清洁的好,残留不同量的未结合的抗体,使后面的结果产生不一致
酶标板底部不净影响吸光度读取 读板前小心清洁酶标板底部

 

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