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小爱科普:荧光染料之区室和细胞器特异性染料和离子成像

时间:2019-10-14 点击次数:3187

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区室和细胞器特异性染料

在荧光显微镜技术中,往往要对溶酶体、核内体等细胞区室以及线粒体等细胞器进行染色。为此,该部分介绍了一系列可供选择使用的特异性染料。
观察线粒体最常用的方法就是利用 MitoTracker®,它是一种可透过细胞的染料,包含轻度巯基化的氯甲基活性部分。正因如此,它可与半胱氨酸残基的游离硫醇基反应,从而与基质蛋白实现共价结合。MitoTracker® 有不同的颜色和修饰类型(参见表 1),此外,它还是 Molecular Probes 的商标。与罗丹明 123 (Rh123) 或 tetramethylrosamine等常规线粒体特异性染色剂不同,在用固定剂破坏膜电位后,MitoTracker®不会被洗掉。
依据线粒体染色剂,还有些染料可以标记溶酶体等酸性区室,这类染料被称为LysoTracker。它们由连接一个荧光基团的弱碱基团组成,具有膜穿透性。最有可能的情况是,这些碱基因质子化作用的影响而对酸性区室具有亲和性。LysoTracker具有多种不同的颜色可供选择(参见表 1)。
与溶酶体相似的区室是酿酒酵母等真菌中的液泡,这种膜密闭空间也是一种酸性环境。如果要在荧光显微镜下观察上述区室,则要使用FM 4-64®或FM 5-95®等苯乙烯基染料。
对于蛋白质分泌实验,内质网 (ER) 具有重要的研究意义。对上述区室进行染色的一种典型染料为DiOC6(3)。该染料虽然偏好 ER,但仍会结合线粒体等其他细胞器膜。对ER 进行特异性染色的另一种方法是,使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker,而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的两种染料,其与格列本脲(一种磺酰基脲酶)连接,并可与仅存于内质网膜上的ATP敏感性钾通道结合。BODIPY(硼-二吡咯亚甲基,boron-dipyrromethene)是一种几乎不溶于水的、对pH 相对不敏感的染料基团,该染料对蛋白质标记没太大用处,但却是脂质和膜标记的良好工具。
对于与ER相邻的高尔基体,可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等荧光神经酰胺类似物对其进行标记。 上述神经酰胺为鞘脂类,其在高尔基体中高度富集。
借助基于脂质的染料,可以对脂筏等特异膜区域进行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以观察胆固醇富集区域(Avanti Polar Lipids)。
除了使用特异性非蛋白荧光染料对细胞区室进行标记之外,还可以借助对细胞中不同位置有偏好的蛋白质对目标区域进行染色。这些蛋白质可以和荧光染料相连,并可通过荧光显微镜进行观察。运用这种方法的一个实例是:麦胚凝集素(WGA) 可以与细胞质膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特异性结合,将WGA 与荧光染料偶联,这样我们就可以观察到细胞质膜了。
图 1:Pukinje细胞,小鼠小脑皮质三重标记的纵侧截面图。红色:anti-calbindin-D28k/Cy3;绿色:anti-GFAP/Cy5;蓝色:Hoechst 33258
图 2:牛肺部内皮细胞。红色:用 MitoTracker®Red CMXRos 标记的线粒体;绿色:用绿色荧光 BODIPY®FLphallacidin 标记的纤维状肌动蛋白;蓝色:用 DAPI 标记的细胞核。使用三维盲反褶积可以改善该图像的质量。
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离子成像

在有关神经元方面的研究中,观察基因活性或细胞运动等对于了解细胞的离子浓度具有重要意义。钠、钙、氯或镁离子对很多不同的细胞活动都具有较大影响。一般情况下,借助荧光标记的螯合剂可将离子困住,螯合剂在结合相应离子后会改变离子的光谱特性。例如,利用该原理的钙指示剂fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green 等。
对于钠离子的检测,通常使用 SBFI (sodium-bindingbenzofurzanisophthalate) 或Sodium Green。PBFI(potassium-binding benzofurzanisophthalate) 可以检测钾离子。
有趣的是,还存在以蛋白质为主的钙指示剂,其中一种是基于水母化学发光蛋白—水母素。水母素、发光体腔肠素、分子氧和 Ca2+的相互作用会释放蓝光,这是在荧光蛋白质的发现过程中非常著名的机制。
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